2. PCR扩增

(1)标准的PCR反应体系：

加灭菌双蒸水至              50ul

常用的反应体系可分为25ul和50ul，常在0.2ml离心管内配制，可根据自己的需要选择相应的反应体系。PCR反应体系中除引物序列不得改变外，其余如dNTP、TaqDNA聚合酶、引物和模板的用量等均可适当改变，以适应具体的PCR条件并达到实验的要求。

(2) 参与PCR反应体系的因素：参与PCR反应的因素主要包括模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg²⁺和三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。

1) 模板DNA：用于PCR反应的模板即为制备的基因组DNA。

2) 引物：引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。PCR反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。

反应体系中，引物终浓度一般要求在0.1～0.5umol/L之间，浓度太高容易生成引物二聚体或非特异性产物。

3) TaqDNA聚合酶：热稳定DNA聚合酶是PCR技术实现自动化的关键，它在合适的温度和Mg²⁺浓度调控下，使DNA由5'端开始复制到3'端。TaqDNA聚合酶在PCR反应中加入的量也很重要，通常每100ul反应液中含1～2.5U为好，并注意在-20℃贮存。

4) PCR缓冲液：缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，常用10～50mmol/LTris-HCl(pH8.3～8.8)缓冲液。

5) Mg²⁺Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，一般PCR反应体系中Mg²⁺终浓度为1.5～2.0mmol/L，Mg²⁺浓度过高反应特异性降低，易出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

6) dNTP：三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)是dATP、dGTP、dTTP和dCTP的统称，是PCR反应的合成原料。PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性，过高的dNTP浓度会抑制扩增反应。PCR反应中每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为50～200umol/L。

(3) PCR反应程序的设定：标准的PCR反应过程分为三步。

PCR反应程序中的具体时间、温度和循环数依据模板和引物情况而定。同时必须设定阳性和空白对照，PCR阳性对照为采用相应品种的对照药材或符合现行版药典规定的相应药材标本按供试品同样的方法提取的DNA模板；空白对照以灭菌双蒸水作为PCR反应的模板。对照PCR反应体系均与供试品一致。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳，也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60～65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

3. 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。

(1) 试剂

1) DNA分子量标准：电泳一定要使用DNA分子量标准，一般选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

2) 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有溴酚蓝和二甲苯青及银染色。溴酚蓝在碱性液体中呈紫蓝色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈蓝色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相同。

3) 上样缓冲液：一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。可增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内；使样品呈色，便于加样操作；形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。

4) 核酸染色剂：常用溴化乙锭(EB)或GelRed，这两种均为荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光，其荧光强度与DNA的含量成正比，据此可粗略估计样品DNA浓度。EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

5) 电泳缓冲液：核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)，TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE或TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解。

10×TBE：称取108克Tris碱，9.3克EDTA，55克硼酸，加水至1000ml(pH8.0～8.2)，电泳时用水稀释20倍至0.5×TBE工作液。

50×TAE：称取242克Tris碱，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加入适量去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000ml，作为贮存液。进行凝胶电泳时稀释50倍至1×TAE工作液。

6) 1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖，加入100ml1×TAE电泳缓冲液。

(2) 制备：1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，微波炉中火加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液，冷却至65℃左右加入核酸染色剂。

(3) 胶板制备：取制胶槽，放入制胶板，置于水平位置，并在固定位置放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

(4) 加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，用移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个吸头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。加样前要先记下加样的顺序。

(5) 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60～100V，样品由负极向正极方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

(6) 观察照相：在紫外光下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

4. 结果与判定

(1) PCR电泳图谱：电泳图谱应包括DNA分子量标准、供试品、阳性对照和空白对照。

PCR产物与点样孔之间的迁移距离与DNA分子量标准进行对照，即可得到供试品的PCR分子量。

(2) 结果判定：供试品凝胶图谱中，在与对照药材凝胶图谱相应位置上有相应的单一DNA条带，即扩增片段与预期片段一致，而空白对照中皆没有相应的DNA条带，表明该样品为阳性结果，报告供试品符合规定。

(四) 注意事项

PCR反应的最大特点是具有较强的扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

1. 污染原因主要有标本间交叉污染，PCR试剂的污染，最常见的是PCR扩增产物污染，主要形式是气溶胶污染。

2. 防止污染的方法

(1) 实验室合理分区：最好能划分样本制备区、PCR反应液制备区、PCR扩增区、PCR产物分析区。

(2) 移液器的污染：加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢尽量一次性完成，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

(3) 预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，避免污染机会。另外，PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

(4) 实验用品及移液器应专用。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA，防止操作人员污染。

(5) 使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性使用。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高温高压消毒；设立适当的阳性对照和阴性对照。

(6) 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。

(7) 由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积于管底。

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。