PCR技术应用于微生物检测， 具备快速灵敏、特异性强等优点。在医学微生物、食品微生物、环境微生物等领域， 有关PCR快速检测的理论研究很多， 并有多种商品化试剂盒研制成功。

(一) PCR检测微生物的原理

PCR扩增DNA， 其选择性体现在引物上， 因为引物决定了扩增区域和扩增片段长度。从理论上说， 在细菌DNA高度保守区内设计引物， 则所有细菌都可有片段扩出；如果在细菌属特异性区域内设计引物，则只有本属细菌能被扩增；如果在种特异性区域内设计引物，就只有该种细菌有特定片段扩出。那么反过来，可以根据已知的细菌遗传信息， 设计出某种特定引物， 进行PCR。如果有特定长度的扩增产物出现， 则说明扩增模板是这类细菌的DNA， 也即有这类细菌存在， 反之则无。这就是PCR检测微生物的基本原理。由于PCR反应仅需2~3h， 因此有可能使原来需要数天培养的常规检测在数小时内完成； PCR可直接对特定基因区域扩增， 这样就省去了繁琐的生理生化反应进行种属鉴定、血清分型等工作，也使检测工作大为简化，因而具有很大的优越性。

(二) PCR检测微生物的操作程序

应用PCR检测微生物， 主要包括以下几个步骤。

1.目的微生物的浓集(增菌)

某些待检微生物的浓度很低， 往往需要浓集才能达到PCR检测的要求。并且， PCR反应很难达到1个分子的极限灵敏度， 且不论操作过程中的菌量损失和DNA提取效率的影响。所以说很多情况下， 目的微生物的浓集是必要的。浓集方法常有离心法、滤膜收集法、物理吸附法等。有时浓集方法效果不理想或不宜浓集时，将待检样品进行前培养预增殖也是必要的。

2.核酸的提取

从样品中浓集到目的微生物后，必须经过适当处理，使其核酸暴露出来，小能用于PCR扩增。处理的方法有加热(95~99℃) 、反复冻融和化学试剂裂解等。当直接用细菌製解物进行PCR时， 应注意细菌蛋白可能会抑制Taq酶的活力。有实验表明， 细菌浓度只要不超过100CFU/uL， 裂解后的核酸可直接用于PCR， 不需进一步纯化。

3.PCR扩增

PCR特异性扩增的关键在于引物， 引物的优劣直接关系到PCR的特异性和成功与否。引物的设计原则见前述。此外， PCR参数的优化选择也是一个重要因素。退火温度是很重要的因素，如果扩增不需要高度特异性或严格性，则用较低的退火温度； 如需严格性的扩增， 则用较高的退火温度产生较少的尤关DNA片段。一些特定的实验，需在理论退火温度(T)附近进行梯度试验，以获得最佳退火温度。其他因素也影响PCR的特异性， dNTP、引物、Mg²⁺、DNA多聚酶等浓度可有所不同。通常为了尽可能减少非特异性扩增产物和引物二聚体的出现概率，一般采用较低的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度和引物浓度， 采用热启动也可减少非特异性产物。

4.PCR扩增产物的检测

常用的PCR扩增产物检测方法为琼脂糖凝胶电泳法。用于DNA电泳的琼脂糖质量分数为0.8%~2%。琼脂糖质量分数根据待分离的DNA片段大小而定：待分离片段相对分子质量越小，则琼脂糖质量分数应越大，反之亦然。电泳完毕冉经过溴化乙锭(EB) 染色后， 在紫外灯下观察结果。EB是一种荧光染色剂， 它能插入DNA碱基间， 经紫外光激发放射出橙红色； 这样经EB染色的DNA片段很容易在紫外灯下被观察到。DNA片段大小可通过与DNA相对分子质量标准对比而估计出。

文章来源：《食品快速检测实训教程》

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