2.2.5.7分析条件的选择

(1)提取净化方法的优化

由于甲氧苄氨嘧啶和其他磺胺的结构有差别，而它们具有不同的pK和溶剂亲和力，难以在常用的有机溶剂中同时提取。尝试用乙酸乙酯、酸化乙酸乙酯、乙腈乙酸乙酯混合溶液、氯仿丙酮混合溶液作为提取剂，提取2次，结果多数磺胺可被提出，回收率在50%～84%之间，但甲氧苄氨嘧啶几乎就没被提取出来。若调节样品为碱性则多数磺胺不能被提出。

考虑到后续的净化过程，对0.33mol/L高氯酸及水按三个不同的比例(1+4，2+3，3+2)进行混合，5mL溶液中加入待测的16种物质，过MCX柱，用5mL水，5mL甲醇淋洗，5mL 25%氨水甲醇洗脱，浓缩后仪器分析，发现单纯做试剂添加，16种物质回收率在95%以上。于是利用0.33 mol/L高氯酸+水(1+4，v/v)对牛奶进行提取2次，离心后上清液过MCX柱净化，25%氨水甲醇洗脱，浓缩后仪器分析，结果发现，磺胺醋酰回收率在10%以下，磺胺二甲基异噁唑的回收率在40%左右，其他14种磺胺的回收率在65%～110%之间。后在提取剂中加入不同比例的甲醇，磺胺类药物残留回收率未见明显改观。继续利用高氯酸溶液提取，过HLB柱净化，利用不同浓度的高氯酸提取过HLB柱，用水淋洗，甲醇洗脱。当高氯酸的浓度太大时，对HLB柱有影响，磺胺回收率会很低，调节高氯酸的pH为2时，试剂添加中磺胺的回收率在95以上，在此条件下对牛奶中的磺胺进行提取并净化，如果对提取液进行离心，上清液过HLB柱，磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的回收率在40%～50%，其他磺胺回收率在70%～105%；如果用乳浊液直接上HLB柱，16种磺胺都在都获得较高的回收率。按照牛奶样品的预处理条件来处理奶粉样品，单纯采用pH为2的高氯酸溶液作为提取剂，以乳浊液的形式通过HLB柱，用水淋洗，甲醇洗脱，回收率会同样较高。

在洗脱过程中，做洗脱曲线，可知前2mL甲醇会将将分析物全部洗脱下来，所以采用3mL甲醇洗脱。同时磺胺类药物热不稳定，在40℃氮吹吹干，就有将近20%的损失，浓缩一步应注意不能将其完全吹干，待洗脱液吹至约0.2mL时，利用定容液将其补至1mL。定容液的选择使最后进仪器样液的比例与流动相的初始值接近。

(2)色谱条件的建立

实验采用了0.1%乙酸-甲醇做流动相，采用时间梯度洗脱，在150mm×2.1mmi.d，粒度5um,的C₁₈柱分离待测组分，分析物在最大程度上得到了分离，且峰对称尖锐，加之质谱的高选择性，通过MRM色谱图能够较好地定性定量16种分析物，无内源干扰物影响组分的测定。

(3) 质谱条件的优化

用蠕动泵以10uL/min注入1ug/mL的16种磺胺混合标准溶液来确定各化合物的最佳质谱条件，包括选择特征离子对，优化电喷雾电压、鞘气、辅助气、碰撞能量等质谱分析条件。分析物的混标液进入ESI电离源，在正、负离子扫描方式下分别对分析物进行一级全扫描质谱分析，得到分子离子峰。16种分析物在正模式下均有较高的响应，负模式下信号值很低。然后对各分子离子峰进行二级质谱分析(多反应监测MRM扫描)，得到碎片离子信息。

2.2.5.8 线性范围和测定低限

根据每种磺胺类药物的灵敏度，用牛奶、奶粉样品空白溶液配成一系列基质标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，进样量10μL，用峰面积对基质标准工作溶液中被测组分的浓度作图，其线性范围、线性方程和线性相关系数见表2-26。本方法采用基质添加标准来校对样品的含量以消除基质的干扰。

表2-26 16种磺胺的线性范围、线性方程和相关系数

由此可见，在该方法操作条件下，磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、甲氧苄氨嘧啶和磺胺二甲基异噁唑等16种磺胺在1～50ng/mL(对应牛奶中磺胺类药物残留在0.5～25.0μg/kg范围内,对应奶粉中磺胺类药物残留在2.0～100.0ug/kg范围内)，响应值均在仪器线性范围之内。同时，牛奶中16种磺胺的检测限(LOD)为0.50ug/kg，奶粉中16种磺胺的检测限(LOD)为2.0ugkg。牛奶中16种磺胺的方法检测限(LOQ)为1.0ug/kg，奶粉中16种磺胺的方法检测限(LOQ)为4.0ug/kg，完全能满足世界各国对进口牛奶及奶粉中磺胺类药物残留的要求。

相关链接：牛奶和奶粉中16种磺胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法（二）

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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