3.1.4.2测定方法

目前AGs残留检测常用的测定方法主要有免疫分析法、微生物法和仪器分析法等。

(1)免疫分析法(immunoassay)

免疫分析法适用于复杂基质中痕量组分的分离和检测，是以抗原、抗体的特异性结合和可逆性反应为基础的分析技术，具有较高的选择性和灵敏度。AGs的免疫分析主要有酶联免疫吸附法、免疫胶体金技术、放射免疫法和免疫传感器等。

1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)

ELISA是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

Loomans等以新霉胺为半抗原，通过碳二亚胺(EDC)偶联到预活化的载体蛋白(钥孔虫戚血蓝蛋白)上，免疫兔子，获得对庆大霉素、卡那霉素和新霉素特异性吸附的多克隆抗体，以此建立了牛奶中庆大霉素、卡那霉素和新霉素残留的竞争性ELISA检测方法。在原料奶(无样品预处理)中，庆大霉素、卡那霉素和新霉素的50%抑制水平(IC₅₀)分别为9ng/mL、21ng/mL和113ng/mL。王忠斌等报道了AGs多残留的ELISA分析方法。以新霉素的降解产物新霉胺为半抗原，采用戊二醛合成新霉胺免疫原，制备出针对多种AGs的多克隆抗体，并使用高碘酸盐法制备新霉胺的酶标抗原，建立AGs的cdELISA方法。该方法对新霉素、庆大霉素和卡那霉素的检测限分别为0.2mg/kg、0.15mg/kg和0.35mg/kg，满足AGs多残留免疫检测的要求。

Solomun等建立了一种能快速、灵敏地定性筛查动物源食品(肉类、肝脏、肾脏、蛋、奶)中新霉素的ELISA方法，并按照欧盟要求进行了方法验证。该方法的LOD为5.7ug/kg(肾脏)～29.3ug/kg(牛奶)，LOQ为11.4ug/kg(肾)～59.7ug/kg(鸡蛋)；添加回收范围为65.8%～122.8%，CV为5.9%～28.6%。

Chen等建立了猪组织中庆大霉素的ELISA检测方法。用庆大霉素-小牛血清蛋白(BSA)偶联物免疫兔子，15次免疫后收集抗血清。优化免疫试剂浓度，间接竞争ELISA(ciELISA)的IC₅₀为0.98ng/mL，直接竞争ELISA(cdELISA)的IC₅₀为0.92ng/mL。通过优化其他参数，cdELISA与其他AGs不发生交叉反应，可以在45min内完成。在25～200ug/kg添加浓度范围，该cdELISA方法的回收率在64.7%～101.2%之间，CV在4.5%～12.1%之间；肌肉中的LOD为6.2g/kg，肝脏为3.6ug/kg，肾脏为2.7ug/kg。Jin等利用单克隆抗体，建立了动物血浆和奶中庆大霉素的cdELISA分析方法。该单抗与其他AGs没有交叉反应。方法LOD分别为0.9ng/mL(PBS)、1.0ng/mL(血浆)和0.5ng/mL(奶)；在25～100ng/mL添加范围，回收率在85%～112%之间。

Jin等制备了卡那霉素的单克隆抗体IgG1，该单抗对卡那霉素有高度特异性，以此建立了动物血浆和乳汁中卡那霉素的cdELISA检测方法。该方法在PBS中的LOD为1.1ng/mL，血浆中为1.4ng/mL，乳汁中为1.0ng/mL。

张桂贤将链霉素与BSA和卵清蛋白(OVA)偶联，免疫BALB/C小鼠，筛选出能稳定分泌单抗的IgG2b型单抗细胞株。注入小鼠腹腔，制备腹水，获得效价为1：51200的单克隆抗体，并建立ciELISA方法。经优化后，该方法在1～10000ng/mL之间线性关系良好，相关系数为0.9726，IC₅₀为33.03ng/mL，LOD为1.0ng/mL。交叉反应实验表明，与双氢链霉素交叉率达127%，与庆大霉素卡那霉素、新霉素无交叉反应。应用于牛奶和鸡肉中的链霉素分析，牛奶中的回收率在68.8%～78.1%之间，鸡肉中的回收率在54.7%～61.2%之间。范国英等研制出快速检测奶中链霉素残留的阻断ELISA试剂盒，用方阵滴定法确定阻断ELISA试剂盒中mAb和GaMlgG HRP的工作浓度，灵敏度为0.37ug/L，具有较高的回收率和准确度，与双氢链霉素的交叉反应为115%，与其他抗菌药物交叉率小于0.001%。

Tanaka等建立了ciELISA法测定鸡的血浆中大观霉素。以大观霉素-BSA偶联物作为免疫原，免疫兔子，获得多克隆抗体，对双氢大观霉素和四氢大观霉素的交叉反应率分别为44.0%和13.8%，而对其他抗生素没有交叉反应。该方法的LOD为2ng/mL，平均回收率达到97%～110%。

Burkin等以多种偶联方式制备安普霉素免疫原和包被抗原,并选出一种与其他类似物没有交叉反应的作为包被抗原。以此建立了猪肾和牛肉中安普霉素的竞争性ELISA检测方法。该方法的LOD为0.015ng/mL，IC₂₀～IC₈₀动态范围为0.03～1.8ng/mL，由于具有高的灵敏度，可以通过稀释提取液来消除基质效应；添加回收率实验表明，方法回收率为85%～105%。

2)胶体金免疫层析(immune colloidal gold technique, GICT)

GICT是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子等生物大分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应等再进行检测。
Verheijen等开发了一种基于竞争性免疫测定的胶体金试纸条方法。检测试剂由包被有抗(双氢)链霉素单克隆抗体的胶体金粒子组成，捕获试剂是被固定在该试验装置的横向流动膜上的链霉素-BSA偶联物。在测试过程中，试纸条样品阱中滴入三滴原料奶，并在膜上迁移。样品中的分析物越多，与膜上固定的链霉素竞争检测试剂中有限抗体的作用就越强，样品中足够量的(双氢)链霉素将抑制膜上固定的链霉素与检测试剂结合，导致读出区域中测试线消失。原料乳中链霉素和双氢链霉素的LOD分别为160ng/mL和190ng/mL。该试纸条可以在10min内得出结果，且不需要其他试剂和仪器，适合基层推广使用。倪同浩采用单克隆抗体技术和GICT技术，成功研制了链霉素胶体金免疫层析试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，胶体金标记抗体经纯化后吸附在玻璃纤维素膜上；将检测线(Str-OVA)和质控线(羊抗鼠IgG)分别包被在硝酸纤维素膜上。分别经过处理干燥后与样品垫、吸水纸组装成试纸条。使用试纸条对链霉素标准液检测，LOD为100ng/mL，且对新霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、恩诺沙星、氨苄青霉素、磺胺喹噁啉无交叉反应。实验初步建立了牛奶、奶粉、蜂蜜等样本的样品处理方法，并用ELISA方法和试纸条进行验证，结果表明试纸条能够基本满足检测要求。

3)放射免疫法(radioimmunoassay， RIA)

RIA是利用放射性元素标记的分析物与样品中的分析物竞争性结合有特殊位点的受体，受体存在于微生物细胞表面并被添加到样品中，然后利用液体闪烁仪计数，通过检测放射性元素标记的分析物量，推算出样品中分析物的含量。

秦燕等对比研究了ELISA和CharmlI RIA法检测鸡肝中链霉素残留的结果。在ELISA方法中，链霉素在0.5～128.0μg/L的范围内线性良好，LOQ为0.03mg/kg；在RIA方法中，链霉素在25～500ug/L的范围内相关性较好，筛选水平为0.2mg/kg。两种方法的检测限、精密度和回收率均符合鸡肝链霉素残留监控的MRL要求。龙朝阳等用放射标记的药物与样品中的残留药物竞争可利用的细胞受体部位，样品经离心，除去上清液，沉淀在β-闪烁液中重新悬浮，用液体闪烁计测量放射强度，确定了试剂的阴性控制点和筛选水平。结果得出，链霉素和庆大霉素分别在0～50ug/L、0～25ug/L呈良好的线性关系。与ELISA法比较，RIA法前处理简单、快速，可用于动物源食品中AGs的快速检测，但由于存在放射性污染，实验操作难以控制，费用较高，目前已较少应用。

4)免疫传感器(immunosensor)

免疫传感器就是利用抗原(抗体)对抗体(抗原)的识别功能而研制成的生物传感器，它将传统的免疫测试和生物传感技术融为一体，集两者的诸多优点于一身，不仅减少了分析时间，提高了灵敏度和测试精度，也使得测定过程变得简单，易于实现自动化，有着广阔的应用前景。

Haasnoot 等应用与4种特异性抗体的混合物组合的四通道光学生物传感器，构成了竞争性抑制免疫测定法的生物传感器(BIA)，用于同时检测重组脱脂牛奶中的5种AGs。庆大霉素、新霉素、卡那霉素和链霉素衍生物通过氨基偶合，被固定到该生物传感器芯片的传感器表面。牛奶(从脱脂奶粉复原)用4种抗体混合物进行10倍稀释，通过四个串联连接的通道注入。注射再生溶液(0.2mol/L NaOH+20%乙腈)之前所测得的响应值可以指示复原乳中AGs的存在与否。该方法的LOD在15～60ng/mL之间，总计运行时间为7min。Baxter等也利用光学生物传感器检测巴氏灭菌奶中的链霉素。链霉素-己二酰肼结合物与牛甲状腺球蛋白偶联，免疫绵羊获得多克隆抗体，该抗体与双氢链霉素的交叉反应率为106%，但与其他抗生素没有交叉反应。链霉素也被固定到一种CM5传感芯片，以提供一个稳定的、可重复使用的表面。该方法不需前处理和脱脂，可用于直接分析全脂牛奶样品，5min即可获得结果。方法的LOD为4.1ug/L；CV为3.5%～7.6%

Ferguson等报道了采用免疫生物传感器检测牛奶、蜂蜜、猪肾、猪肌肉中链霉素和双氢链霉素残留的方法。选用的抗体具有高度的特异性，与其他AGs和抗生素没有交叉反应。链霉素衍生物用于制备稳定、可重复使用的传感器芯片表面。对多种样品进行了检测，LOD分别为：牛奶30ug/kg，蜂蜜15ug/kg，肾组织50ug/kg，肌肉组织70ug/kg。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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