(3)净化方法

对动物基质进行样品预处理，是保证残留检测结果可靠的前提。通常初步的提取液中CAPs浓度很低，还含有许多脂肪等共萃取物，这些共萃取物如果存在于最终的样品溶液中，不仅会损害检测仪器，还会降低柱效以及干扰检测结果，影响色谱分离及检测的正常进行。常用的净化方法有液液分配(LLP)、固相萃取(SPE)、基质固相分散(MSPD)和免疫亲和色谱(IAC)等。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP作为一种常规的净化方法在CAPs残留分析中应用广泛，常用正己烷或异辛烷除去提取液中的脂类物质。但LLP易出现乳化现象，对操作者的经验和技巧有一定的要求。一般LLP净化后还需要进一步的净化措施如固相萃取来处理样液。

van de Riet等采用丙酮提取水产品中的CAP、TAP、FF和FFa，提取液再用二氯甲烷反萃取，蒸干后，用稀酸溶解，正己烷LLP除脂，LC-MS测定。方法回收率在71%～107%之间，RSD小于10%；CAP和FF的CCa为0.1ng/g，TAP为0.3ng/g，FFa为1.0ng/g。Rocha Siqueira等用磷酸提取鸡蛋、虾、鱼、鸡、猪、牛肉中的CAP，再用乙酸乙酯LLP反萃取，LC-MS/MS检测。方法回收率在85%～120%之间，RSD小于20%，LOQ为0.1ug/kg。Rodziewicz等用乙酸乙酯提取均质后动物样品，蒸干提取液，用乙腈复溶，加入正己烷LLP净化，再用LC-MS/MS测定。方法回收率在76.3%～100.3%之间，CCa在0.137～0.205ng/g之间，LOQ为0.1ng/g。

2)固相萃取(solid phase extraction， SPE)

用于CAPs残留分析的SPE柱填料种类较多，主要有C₁₈、HLB、MCX、Chem Elut、Florsil等。

A.C₁₈柱

彭涛等用碱化乙酸乙酯提取虾中的CAP、TAP和FF，浓缩提取物经LLP去除脂肪后，加入0.05%醋酸溶液复溶，过C18 SPE柱(用5mL甲醇，5mL水平衡)，3mL水洗涤，3mL甲醇-水(60+40，v/v)洗脱，采用LC-MS/MS检测。方法LOD为：CAP和FF 0.01ng/g，TAP0.05ng/g；在添加浓度0.1～2.0ng/g范围内，CAP回收率为73.9%～96.0%，TAP为78.6%～99.5%，FF为74.9%～103.7%，RSD均小于6.4%。Santos等用pH6.0 0.1 mol/L的磷酸缓冲液提取虹鳟鱼中的CAP，离心后，用正己烷LLP除脂，乙酸乙酯反萃取，蒸干提取液后，用水复溶，过C18 SPE柱净化，LC-MS/MS测定，方法CCa为0.267ug/kg。

Tian分析牛奶中的CAP，乙腈提取液过C₁₈ SPE柱净化后，采用LC-MS/MS检测。方法回收率为71%～107%，RSD小于13.7%；CAP的LOQ为0.03ug/kg。Silva等用乙酸乙酯提取羊奶中的CAP，再用C₁₈ SPE净化，气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)检测。方法回收率为69.87%～73.71%，RSD为5.8%～13.4%；LOD和LOQ分别为0.030ug/kg和0.10ug/kg。

Vue 等采用C₁₈ SPE柱富积和分离淡水鱼血浆中的FF，再用HPLC-UVD检测。方法回收率为84%～104%，RSD小于8%：LOQ为30ng/mL。

Gantverg等测定尿液中的CAP，用磷酸缓冲液稀释后，加β-葡萄糖苷酸酶水解轭合药物，再用乙酸乙酯提取，经C₁₈固相萃取柱净化后，用LC-MS/MS测定。方法回收率大于80%，RSD为13.4%～29.2%，LOD为0.02ug/kg。

B.HLB柱

Shen等采用乙酸乙酯提取肌肉和肝脏中的CAP、TAP、FF和FFa，冷冻除脂后，再用正已烷LLP净化，接着过HLB柱，经衍生化后，用气相色谱-质谱(GC-MS)测定。方法回收率在78.5%～105.5%之间，RSD小于17%；CAP的LOD为0.1ug/kg，TAP、FF和FFa的LOD为0.5ug/kg。

占春瑞等建立了一种同时测定水产品中TAP和FF残留的分析方法。样品经乙酸乙酯提取，正己烷LLP除脂，过HLB柱净化，用3mL 10%甲醇淋洗，5mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干，1mL 10%乙腈溶液定容，UPLC-UVD测定。TAP和FF的平均回收率分别为80.0%和95.8%，RSD分别为5.6%和11.2%，LOD分别为10ug/kg、5ug/kg。Gikas等用HLB柱净化海产品中的CAP，方法回收率达与90%，LOQ为0.02ug/kg。

Chen等测定牛奶中CAP时，直接过HLB柱净化，水淋洗后，抽干5min，正己烷淋洗脱脂，乙酸乙酯洗脱，蒸干洗脱液后，醋酸铵-乙腈(90+10，v/v)复溶，用UPLC-MS/MS检测。方法回收率94.9%～103.6%。Vargas Mamani等采用甲醇提取牛奶中的CAP等药物，经HLB柱净化后，HPLC测定。方法回收率和灵敏度均满足残留分析要求。Wang等用Mllvaine缓冲液-甲醇(8+2，v/v)提取牛奶中的CAP和TAP，过HLB净化后，UPLC测定。方法回收率分别在52.1%～101.0%之间，LOD和LOQ分别在0.003～0.022ug/g和0.01～0.08ug/g之间。

Ishii等建立了蜂蜜和皇浆中CAP的残留分析方法。蜂蜜用水稀释，皇浆用1%偏磷酸-甲醇(4+6，v/v)提取，提取液过HLB柱净化，LC-MS/MS测定。蜂蜜和皇浆中LOQ分别为0.3ng/g和1.5ng/g，回收率均为92%。Verzegnassi等采用醋酸缓冲液稀释蜂蜜样品，经HLB柱净化后，LC-MS/MS测定。方法准确度优于15%，重复性和重现性分别为12%和18%；CCa和CCβ均优于0.1ug/kg。

C.MCX柱

FFa为弱碱性化合物，常用MCX等阳离子交换柱进行净化。以酸性溶液上样，再用碱性有机溶剂洗脱。Zhang等建立了同时检测鱼、虾和猪肉中FF和FFa的GC-ECD方法。提取液旋转蒸干，5%乙酸溶液复溶后，加入正己烷除脂，离心后过MCX柱(3cm³，60mg)净化，5%乙酸-甲醇(80+20，v/v)淋洗，10%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，衍生化后上机分析。该方法测得鱼、虾和猪肉中FF、FFa平均回收率分别为81.7%～109.7%、94.1%～103.4%、71.5%～91.4%；FF和FFa的LOD分别为0.5ng/g、1ng/g。该作者提取鸡肉中CAP、TAP、FF、FFa，蒸干提取液后，用5%乙酸水溶液复溶，正己烷脱脂，MCX柱净化，LC-MS/MS检测。方法LOD：CAP为0.1ug/kg，TAP、FFa为1ug/kg，FF为0.2ug/kg，回收率在95.1%～107.3%之间，日内和日间RSD分别小于10.9%和10.6%。

D. Chem Elut柱

Ronning等将血浆和尿液直接通过Chem Elut SPE柱，正己烷淋洗净化，乙酸乙酯洗脱，蒸干后用甲醇-水(3+4，v/v)复溶，LC-MS/MS测定。方法CCa为0.02ug/kg，CCβ为0.04ug/kg，室内RSD小于25%。Rodziewicz等用水稀释尿液，过Chem Elut SPE柱净化，乙酸乙酯洗脱，LC-MS/MS测定。方法平均回收率在91%～100%之间，室内RSD小于9%，室间RSD小于10%；CCa和CCβ分别为0.08ug/kg，为0.1ug/kg。

E. Florsil柱

Nagata等用乙酸乙酯提取动物肌肉和鱼肉中的TAP、FF、CAP，浓缩至干，用3% NaC1溶液复溶，正己烷LLP去除脂肪，过Florisil柱净化后，HPLC-UVD测定。方法回收率达与74.1%，LOD为0.01ppm。李鹏等建立了动物组织中CAP、TAP和FF残留量的方法。用乙酸乙酯提取，正已烷LLP去脂肪，蒸干后用乙醚复溶，过Florisil柱进一步净化，SPE柱依次用乙醚-甲醇(7+3，v/v)和乙醚活化，5mL乙醚淋洗，5mL乙醚-甲醇(7+3，v/v)洗脱，以甲苯为反应介质，用N，O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1，v/v)进行硅烷化衍生，GC-MS测定。CAP的LOD可达到0.03ug/kg，TAP和FF可达到0.2ug/kg；方法回收率为80.0%～111.5%，RSD为1.2%～15.4%。

F.联合用柱

为了保证净化效果，提高检测灵敏度，联合用柱越来越多用在CAPs的残留分析中。Shen等用pH6.88的磷酸盐缓冲液-乙酸乙酯提取海产品、蜂蜜、肉等动物源食品中的CAP，正己烷LLP去除脂肪，接着用硅胶柱和C₁₈柱净化，衍生化后，用GC测定。方法LOD为0.1ugkg，平均回收率为75%～120%，RSD为5.4%～8.1%。Pfenning等用碱性乙酸乙酯和乙腈提取虾中的CAP、TAP、FF和FFa，提取液蒸干用水复溶，酸化后，用正己烷LLP除去脂肪，再过丙磺酸(PRS)柱和C₁₈柱净化。C₁₈柱用甲醇洗脱，PRS柱用碱性甲醇洗脱，蒸干洗脱液，用乙腈复溶，经Sylon BFT衍生后GC测定。方法回收率为84%～101%，CV为5.3%～12.8%；LOQ为5ng/g。Fujita等用甲醇-1%偏磷酸提取蜂花粉中的CAP后，用聚合物SPE柱和中性氧化铝柱联合净化，LC-MS/MS检测。方法回收率为98%～113%，CCa在0.05～0.07ug/kg之间，CCβ在0.08～0.12ug/kg之间。谢文等采用10%偏磷酸沉淀蜂王浆和蜂蜜中的蛋白质，上清液经乙酸乙酯提取，自制硅胶柱和HLB柱净化，LC-MS/MS检测。该方法对不同基质样品的加标回收率为91%～107%，RSD小于10%；蜂蜜和蜂王浆的LOD分别为0.1ug/kg和0.2ug/kg。

G.其他

Lu等用乙腈提取鸡蛋、牛奶、蜂蜜中的CAP，提取液经以多壁碳纳米管作为吸附剂材料的SPE柱净化后，LC-MS/MS检测。平均回收率在95.8%～102.3%之间，日内和日间RSD分别小于7.13%和8.89%。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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