3)基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion， MSPD)

MSPD可同时实现样品的均质、提取和净化。在MSPD中吸附剂与样品一起混合研磨，样品均匀分散于吸附剂键合相，形成一个独特的色谱固定相。吸附剂同时起着支持剂、分散剂、吸附剂、净化剂的作用，待测物在吸附剂、洗脱液和样品基质之间进行吸附与分配，最终达到萃取与净化双重效果。常用MSPD吸附剂主要有C₁₈等。

奉夏平等将匀浆后的组织样品放入研钵中，加入石墨化碳黑和C18混匀，研磨。在层析柱中依次加入无水硫酸钠、氧化铝、C₁₈，敲实、压紧后，把研磨的混合物装入层析柱中，在混合物上再加入无水硫酸钠，敲实、压紧，制备成MSPD柱，用正己烷淋洗柱子，抽干，再用乙酸乙酯洗脱。CAP经衍生化后用GC-MS测定。该方法LOD为5pg/g，回收率在95.88%～107.69%之间。Kubala-Drincic等采用MSPD提取净化动物肌肉中的CAP。肌肉与C₁₈填料混合装柱，分别用正已烷和乙腈-水(5+95，v/v)洗涤，乙腈-水(50+50，v/v)洗脱，乙酸乙酯反提，蒸干后用Sylon HTP衍生化，GC测定。在5ug/kg、10ug/kg、15ug/kg添加浓度，平均回收率分别为93%、96%和98%，RSD为13%、11%和3%；LOD和LOQ分别为1.6ug/kg和4.0ug/kg。Lu等开发了一种检测甲鱼组织中CAP的在线MSPD-LC-MS/MS快速检测方法(见图4-1)。将匀浆后甲鱼组织与C₁₈填料混合装入MSPD柱中，用超纯水作为淋洗溶剂，流速为0.2mL/min，淋洗5min，乙腈-水(80+20，v/v)作为萃取剂，流速为0.4mL/min，提取5min。该方法将MSPD与LC-MS/MS在线连接，显著缩短了样品处理时间。方法回收率为92.05%～98.07%，RSD小于4.2%，日内和日间RSD分别为2.05%～8.33%和3.05%～10.17%。

图4-1 在线MSPD-HPLC-MS/MS系统图黑线表明阀在位置A，红线表示阀在位置B

4)免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography， IAC)

IAC利用抗原-抗体反应原理进行净化，具有高度的选择性，是目前净化效果最好的方法。基于IAC方法的检测限主要决定于取样量和分析仪器的灵敏度。

Van de Water等将抗CAP单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖偶联，制备IAC柱，用于猪肉中CAP的净化。猪肉提取液中的CAP被IAC柱吸附，用甲醇洗脱后，HPLC测定。该方法平均回收率为70%，损失主要是在提取过程，而在净化过程中几乎没有损失。Zhang等用抗CAP的单克隆抗体与溴化氢-活性琼脂糖4B制备IAC柱，该IAC柱动态柱容量为3265ng/mL硅胶。鸡组织提取液加入该IAC柱净化，衍生后，用GC-ECD测定。鸡肉的回收率为86.6%～96.9%，鸡肝为74.3%～96.9%；鸡肉的LOQ为0.05ng/g，鸡肝为0.1ng/g。Stidl等利用抗CAP抗体制备了IAC柱，并对IAC柱上样溶剂、流速和洗脱溶剂、流速、体积等进行了优化。用于虾中CAP检测的净化，一根IAC柱可以至少重复使用12次。经HPLC-UVD测定，该方法平均回收率为68%，RSD为4%，LOD为1.8ng/g。Gude等将商品化的由抗CAP多克隆抗体制备的IAC柱用于猪肉、猪肝、猪肾和猪尿中CAP残留分析的净化。当重复使用超过100次后，该IAC柱容量有了显著降低。采用GC-ECD测定，猪肉、猪肝、猪肾和猪尿的平均回收率分别为69%、54%、62%和95%；猪肉的LOD为0.2ug/kg，猪肝、猪肾为2.0ug/kg，猪尿为0.4ug/kg。

van de Water等又将抗CAP单克隆抗体与羰基活化的支持物偶联，制备IAC柱，用于鸡蛋和奶中CAP的净化。该IAC柱可以重复使用30次，而柱容量不会下降。鸡蛋匀浆后的上清液和脱脂奶直接加到IAC柱中，用0.2 mol/L甘氨酸和0.5 mol/L pH2.8 NaC1洗脱后，HPLC测定，没有发现基质干扰。牛奶的回收率为9%，通过增大取样量，LOD可以降低到20ng/kg。Gallo等用乙腈提取牛奶中的CAP，经以a-1-酸性糖蛋白(AAG)为载体的IAC柱净化后，用液相色谱-离子阱质谱(LC-MSn)测定。方法灵敏度满足0.30ppb的检测要求，其他技术指标符合欧盟指令2002/657/EC的规定。
Luo等利用FFa作为模板分子，与牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白(OVA)分别合成免疫原和包被原，免疫兔子制备多克隆抗体。用纯化的抗体与蛋白A-琼脂糖CI4B制备IAC柱，用于净化、提取猪肉中的TAP、FF和FFa。IAC柱用甲醇-甲酸(9+1，v/v)洗脱后，LC-MS/MS检测。该方法回收率在85.2%～98.9%之间，CV小于9.8%；LOD为0.12～0.6ug/kg，LOQ为0.4～4.0ug/kg。循环使用15次后，该IAC柱的动态柱容量还能达到512ng/mL硅胶。

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文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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