1 提取和净化

样品提取溶剂的选择取决于黄曲霉毒素自身的物化性质，一般用到的提取溶剂有甲醇、乙腈的水溶液，尽管早期的方法中经常用到氯仿，但考虑到氯仿对环境的影响，现已基本上被替代；一些新的提取技术，如超临界流体萃取[1,2]、加压流体萃取（加速流体萃取）[3]被用于黄曲霉毒素的提取，但是超临界流体的提取物常有大量的杂质，而加压流体萃取设备价格昂贵，限制了其广泛使用。

样品的提取溶液中常含有共提取物，给黄曲霉毒素的检测带来干扰和基质效应。为了排除基质对分离和检测的干扰，常用的净化手段有液液萃取、固相萃取柱、免疫亲和柱和多功能净化柱。对于含油量大的样品，常需要在提取溶液中加入正己烷用液液萃取法去油；传统固相萃取柱在黄曲霉毒素净化方面的应用较早，填料主要有C18、硅胶、弗洛里硅土、氧化铝等，但由于选择性差，且往往既耗时又浪费溶剂，因此不及免疫亲和柱和多功能净化柱应用广，而微型固相萃取柱的应用便于建立简单快速、成本低廉的前处理方法。Mahoney[4]等采用硅胶柱（30 mg/3 mL）建立了简单可靠的方法来分析检测来自不同植物源的油中黄曲霉毒素，结果表明硅胶柱可以选择性保留植物油中的黄曲霉毒素；Sobolev[5]使用自制氧化铝柱（200 mg/1.5 mL）用于来净化检测主要农产品（玉米粉、棉籽、花生、杏仁、英国胡桃、巴西坚果、阿月浑果）中的黄曲霉毒素，该方法简单快速，成本低廉。由于弗罗里硅土对黄曲霉的吸附能力强，因此用弗罗里硅土柱净化洗脱需要用到大量的丙酮-水溶液[6-8]；Sobolev[9]对于弗罗里硅土柱（130 mg/1.5 mL）净化的的洗脱条件进行了研究，结果显示丙酮/水/甲酸(96:3.7:0.3, v/v)为洗脱溶剂时的洗脱能力最强，2 mL的洗脱体积即可得到大于98%的回收率；该净化方法用于花生、巴西坚果、玉米、棉籽等样品基质，其中花生基质中B1定量限达到0.05 µg/kg；使用商品化的弗罗里硅土柱[10]可以保证样品检测的重复性，同时可进行实验室间结果比对。

2 荧光检测法

荧光检测器在黄曲霉毒素检测中的应用较早，技术较为成熟。黄曲霉毒素共有的香豆素结构使荧光检测法成为首要检测方法，黄曲霉毒素在波长360nm的激发光下能发射出波长420nm的荧光。由于B1和G1分子的二呋喃结构中碳碳双键的吸电子诱导效应，致使分子荧光强度减弱，影响了方法的灵敏度和检出限。通过对双键衍生变成饱和碳碳单键可增强B1和G1的荧光强度，通常采用的衍生法有柱前三氟乙酸衍生、柱后碘衍生、柱后溴衍生和柱后光化学衍生，这四种衍生方法目前均被AOAC官方方法采用。柱前三氟乙酸衍生时需要在前处理部分增加衍生步骤，增加了前处理的时间以及结果的不确定度，同时B1、G1的衍生产物B2a、G2a存在稳定性的问题。碘衍生法是饱和碘溶液和B1、G1在60～75 ℃下发生衍生反应，由于衍生池增加了柱后死体积，易造成色谱峰变宽，且每次都要配制新鲜的溶液。

溴比碘的氧化性更强，反应效率更高，但由于溴本身不稳定，不宜直接作为衍生试剂使用，衍生时采用以下两种方式，一种是在柱后衍生泵中加入三溴化吡啶鎓（PBPB），室温下与B1、G1发生反应；另一种是在流动相中加入溴化钾和硝酸，利用Kobra cell仪电化学在线产生的溴进行柱后衍生。光化学衍生（PHRED）是将反应线圈绕在紫外灯外，当流动相进过反应线圈时，B1、G1被衍生成荧光较强的B2a、G2a，类似于B1、G1和三氟乙酸的反应。Walking[37]将光化学衍生和Kobra cell电化学衍生法、碘衍生法进行了比较，在花生中光化学衍生具有和后两者相当的效果，但在玉米中偏差较大。

除化学衍生外，环糊精也可以增强黄曲霉毒素B1、G1和M1的荧光强度，不过环糊精和黄曲霉毒素间的作用机制尚无定论。荧光检测法需要在提取阶段进行比较才彻底的净化，任何残留的荧光性杂质都可能造成对阳性的误判，报出假阳性的结果。荧光检测法必须确保目标物的完全分离，当其他真菌毒素和黄曲霉毒素同时检测时，就对分离提出了更高的要求。