培养指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长、分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

1．培养方法

(1)固体培养法固体培养最常用的凝固剂是琼脂，使用浓度为5～16g／L。另外一种常用的是植物凝胶，常用浓度是1．5～2．5g／L。固体培养的最大优点是简单、方便。但缺点是：①只有外植体的底部表面才能接触培养基，吸收营养，上面则不能，影响生长速度；②外植体插入培养基后，气体交换不畅，代谢的有害物质积累，造成毒害，影响外植体的生长；③组织受光不均匀，细胞群生长不一致。因此常有褐化、中毒等现象发生。

(2)液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。这种方法可用于单细胞(如花药)、由少数细胞构成的细胞块(愈伤组织)的培养或原生质体的培养等。

静止滤纸桥培养是陈瑞铭1964年发明的，主要用于胚培养和愈伤组织培养等的一种液体培养方法。在一标本缸内放置一玻璃制成的架子，架子上放置一玻璃船，船内装培养液，船边悬挂滤纸。缸盖是一张带3个孔的玻璃板，两侧的孔供气体进出，中间的孔用作向玻璃船内灌注培养液。器官可以贴在滤纸上进行培养，营养的供应主要靠滤纸的虹吸作用。优点是可持续地、适量地获得营养，一个支持面可以同时培养较多的外植体，能随时收集培养液或外植体进行分析、观察。

2.培养条件

接种后的外植体应送到培养室去培养。植物细胞组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。

(1)光照光照是组织培养中的重要外界条件之一，对离体培养物的生长和分化有很大的影响，表现在光照、光质和光周期等方面。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。

有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎只有在暗培养的条件下才能诱导出愈伤组织。有一些植物（如荷兰芹）的组织培养其器官的形成不需要光，而另一些植物则光照可提高幼苗的分化率。一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少的光。

但器官分化需要光照，并随着幼苗的生长需要加强光照，进而可以使小苗生长健壮，促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。即移植到试管外的幼苗的光强度比移植前培养的光强度有所提高，并可适应强度较高的漫射光（(4000lx左右），以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。普通培养室要求每日光照12-16h，光照强度1000~5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。

光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗，11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝光下12周后才出现愈伤组织；白光下则未见愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。不同的植物对光的要求不同，需不断地积累和实验才能掌握不同植物的培养规律。在一般的组织培养中，往往忽略光质的影响。

光周期对试管苗的增殖和分化有一定的影响。选用一定的光周期进行外植体培养，对光周期敏感的植物的外植体分化诱导非常重要。

(2)温度培养温度对植物细胞生长有重要影响。通常植物细胞培养采用25℃。

①离体培养条件下的温度控制原则温度控制主要依据植物种的起源和生态类型来确定。将植物分为喜温性植物和冷凉性植物两大类。喜温性植物培养温度一般控制在26-28℃比较适宜。冷凉性植物通常培养温度控制在18-22℃或＜25℃较为适宜、一般温度低于15℃,高于35℃对植物细胞的分裂、分化不利。在细胞脱分化阶段（诱导期）和愈伤组织增殖期（分裂期），温度要求高些，而在器官发生阶段（分化期）要求低些。

②培养周期中的昼夜温差培养过程中采用恒温培养还是变温培养要依植物种类不同要求而定。目前多数植物种，从器官到细胞培养均采用恒温培养。国内有关小麦、水稻花药培养温度试验报道认为：在诱导花药形成愈伤组织时，昼夜恒温较好；在器官分化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的幼苗也健壮。

③低温预处理研究指出，花药离体培养前，实行低温预处理，可以促进植物细胞脱分化和再分化，已成为一项有效的诱导分化措施。

(3)湿度植物细胞组织培养中的湿度影响主要有两个方面：一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%；二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。

湿度过高、过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70％～80％的相对湿度。

(4)氧气植物细胞组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。在固体培养接种时应避免把整个外植体全部埋在琼脂中，以免造成缺氧。

培养瓶盖需要一定的透气性，培养过程中，培养物释放的微量的乙烯和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害培养物。因此，培养室空气循环流通良好非常重要。

(5)培养基的pH通常一般的培养基pH值都在5．6～6．0。如果pH值不适，则直接影响外植体对营养物质的吸收，进而影响外植体的脱分化、增殖和器官的形成。不同植物对pH值的要求不同，如兰花要求pH值5．2或更低一些，而玉米胚乳的组织培养在7．0时愈伤组织的生长较快。

3．培养步骤

(1)初代培养初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系，即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：

①顶芽和腋芽的发育采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生
苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得较多的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少数革本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等。这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。适宜这种再生繁殖的植物。在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。

茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。

用培养定芽得到的培养物一般是茎节较长、有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。

②不定芽的发育在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织。然后经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数情况下先形成芽，后形成根。

另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断的植物激素，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科、松科、银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。

在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、革莓等。

③体细胞胚状体的发生与发育体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗；但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生，初代培养中男有褐化问题值得注意，外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐化，有时甚至会使整个培养基褐化的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑斜其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养，降低培养成功率。

(2)继代培养初代培养的愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质的桔竭、水分的散失以及积累了一些组织代谢产物，因此必须将组织转移到新的培养基上。这种转移过程称为传代或称继代培养。继代培养是初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。

在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成1024株苗。

继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。

在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停进行的过程。

但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。

一般在25～28℃下进行固体培养时，每隔4～6周进行一次继代培养。在组织块较小的情况下，继代培养时可将整块组织转移过去。若组织块较大，可先将组织分成几个小块再
接种。

(3)生根培养当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的莆子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1／2或者1／4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。

诱导生根可以采用下列方法：①将新梢基部浸入50×10-6或100×10-6IBA溶液中处理4～8h。②在含有生长索的培养基中培养4～6d。③直接移入含有生长素的生根培养基中。
上述3种方法均能诱导新梢生根，但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则
不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。

另外也可采用下列方法生根：①延长在增殖培养基中的培养时间。②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步)。③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。④另外少数植物生根比较困
难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。

从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。

但因经胚状体途径发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。

试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将苗移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。实践证明，植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强，而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使基质温度略高于气温2～3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，而且还有利于提前成活。