护色剂是能与肉及肉制品中呈色物质作用，使之在食品加工、保藏等过程中不致分解、破坏，呈现良好色泽的物质。我国食品添加剂使用标准中公布的发色剂有硝酸钠（钾）和亚硝酸钠（钾），它们主要用于肉类加工，用于固定和增强肉的红色，改善肉的感官性状，并兼具抑制细菌，尤其是肉毒梭状芽孢杆菌生长的作用。但摄入多量亚硝酸盐进入血液后，可使正常的血红蛋白变成高铁血红蛋白，从而失去携氧功能，导致组织缺氧，出现头晕、恶心，严重者出现呼吸困难、昏迷等症状，且在一定条件下，亚硝酸盐可与二级胺形成具有致癌作用的亚硝胺类化合物，而硝酸钠（钾）的毒性主要是在食品中、水中或胃肠道内被还原成亚硝酸盐所致。因此，食品标准除规定了发色剂的使用量外，还规定了残留量标准。在GB2760-2011中，目前亚硝酸钠（钾）在允许使用的食品中的最大添加量为0.15g/kg，残留量≤30mg/kg（西式火腿类残留量≤70mg/kg)；硝酸钠（钾）在允许使用的食品中的最大添加量为0.5g/kg，残留量≤30mg/kg（以亚硝酸钠计）。

硝酸盐和亚硝酸盐测定方法很多，公认的测定方法为格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量，锡柱法测定硝酸盐含量。其他还有示波极谱法、气相色谱法、荧光法和离子选择性电极法等。

一、亚硝酸盐的测定

亚硝酸盐的测定方法包括盐酸萘乙二胺比色法、极谱法、荧光法等。此外，还包括离子交换色谱法、流动分析法、差示脉冲极谱法、毛细管电泳法、导数光度法、催化动力学法、气相色谱法以及各种联用技术等。我国的国家标准方法为离子色谱法（GB/T5009.33-2010第一法）、分光光度计法（GB/T5009.33一一2010第二法）、乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定。

1.离子色谱法

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。
不同样品处理方法如下。

(1)水果、蔬菜、鱼类、肉类、蛋类及其制品、腌鱼类、腌肉类及其他腌制品等：称取试样匀浆（精确至0.01g，可适当调整试样的取样量，以下相同），以水洗入容量瓶中，超声提取，每隔5min振摇1次，保持固相完全分散。于水浴中放置，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液离心，上清液备用。

(2）乳和乳粉：称取试样（精确至0.01g)，置于容量瓶中，加水，摇匀，超声，加入3％乙酸溶液，于4℃放置20min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。

取上述备用的上清液，通过0.22μm水性滤膜针头滤器、C18柱，弃去前面3mL（如果氯离子大于100mg/L，则需要依次通过针头滤器、C18柱、Ag柱和Na柱，弃去前面7mL)，收集后面洗脱液待测。

2.分光光度法

亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。

称取（精确至0.01g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于烧杯中，加饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以水将试样洗入容量瓶中，于沸水浴中加热，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。在振荡上述提取液时加入亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入乙酸锌溶液沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。

本方法最低检出限为1.0mg/kg，本实验用水应为重蒸馏水。

油脂多的样品，可冷却使脂肪凝固后再滤去或撇去脂肪；对有色样品，如红烧肉类，可取滤液于容量瓶中，加氢氧化铝乳液定容，过滤取其无色滤液进行比色测定。若加氢氧化铝乳后还有颜色，可加氢氧化铝乳液进行2次甚至3次脱色，直至无色为止。

3.其他方法

除以上两种常见方法外，食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法还包括分光光度法、示波极谱法等。分光光度计法是利用磺胺和N-1一萘基一乙二胺二盐酸盐，使亚硝酸盐显粉红色，然后用分光光度计在538nm波长下测其吸光度。而示波极谱法则是利用样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8一1羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，与标准曲线比较定量。

二、硝酸盐的测定

硝酸盐可用电极法、气相色谱法测定，也可通过被还原为亚硝酸盐来定量。

1.离子色谱法

离子色谱法测定原理、仪器设备等与离子色谱法亚硝酸盐的含量一样。区别主要在于标准溶液不同，及结果计算不同。

2.分光光度计法（镐柱法）

样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N一1一萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。

样品预处理：同“亚硝酸盐的测定—盐酸萘乙二胺法”。

硝酸盐的还原：先以稀氨缓冲液冲洗镉柱，流速控制在3一5mL/min，取处理过的样液于烧杯中，加氨缓冲溶液，混合后注入储液漏斗，使硝酸盐经镉柱还原，收集流出液，当储液漏斗中的样液流完后，再加水置换柱内留存的样液。将全部收集液如前再经镉柱还原1次，收集流出液，以水洗涤镉柱3次，洗涤液一并收集，加水定容。

亚硝酸钠总量的测定：取还原后的样液于比色管中。以下按盐酸萘乙二胺法测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。

本方法硝酸盐最低检出限为1.4mg/kg。如无上述镉柱玻璃管时，可以25mL酸式滴定管代用。在制取海绵状和镉装填镉柱时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化。镉柱填装好及每次使用完毕后，应先用0.1mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，镉柱不用时用水封盖，镉层不得夹有气泡。

为保证硝酸盐测定结果的准确性，应常检验镉柱的还原效率。镉柱维护得当，使用一年效能尚无显著变化。镉柱还原效率的测定：取硝酸钠标准使用液，加入稀氨缓冲液，混匀后按照分析步骤中“硝酸盐的还原”进行操作。取还原后的溶液于比色管中，按照“亚硝酸盐的测定”进行操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量相比较，还原效率应大于98％为符合要求。

在沉淀蛋白质时，硫酸锌溶液的用量不宜过多。否则，在经镉柱还原时，由于加氯化铵缓冲液而生成Zn(OH)2白色沉淀，堵塞镉柱，影响测定。

镉是有毒元素之一，不要接触到皮肤，一旦接触，立即用水冲洗。另外，不要

将含有大量镉的溶液弃入下水道，应处理后弃去。

三、电极测定法

在0.1mol/L硫酸钾介质中，用硫酸银去除氯离子的干扰，硝酸根离子浓度在1×10-2~8×10-5mol/L之间，电位值与硝酸根浓度的负对数呈线性关系，由此可求出样品中硝酸盐的含量。

准确取切碎混匀的样品置于研钵中，加入少量硫酸钾溶液磨匀后，用硫酸钾溶液稀释，摇匀，离心，吸取上清液，置于小烧杯中，加入硫酸银，用磁力搅拌器搅拌，静置后，取部分上清液约置于另一小烧杯中，插入电极，在磁力搅拌下读取电位值，然后根据标准曲线求出待测液中硝酸盐的含量。

离子选择电极法是一种快速、简便、准确的方法，测定硝酸盐的线性范围宽，在1×10-2~8×10-5mol/L之间，方法简单易行，便于掌握和操作，溶液有颜色或混浊时均不影响测定，适合于批量分析。

硝酸银电极使用前应在0.01mol/L硝酸钠溶液中浸泡1h，然后水洗30min至空白电位达320mV以上。

此法亚硝酸盐含量占硝酸盐含量的30％一40％时，不影响硝酸盐的测定，若超过该比例，可适当加入一定量的硝酸盐标准溶液，以提高硝酸盐水平。

四、气相色谱法

硝酸根可与苯作用生成硝基苯。硝酸根与苯的反应需要严格控制。按上面镉柱法处理样品，取30mL样品处理液和20mL苯于分液漏斗中，充分振摇后，静置，分层，分出水层，收集于100mL三角瓶中，加10mL苯。滴加50mL80％的硫酸，滴加速度以苯刚刚沸腾或将要沸腾为宜，反应5min。然后将全部混合物移入分液漏斗中，用碳酸钠和水洗苯层，收集苯层。然后用气相色谱法分析生成的硝基苯，以2一氯萘为内标物，给出一定的峰值和保留时间，据此可推算出样液中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。

该方法优点是避免了使用致癌物质蔡胺类的化合物，有色物质也不影响测定，可测定10mg/kg以下的硝基苯，回收率达95％一99%。本方法还可用高锰酸钾将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，测定亚硝酸盐含量。

五、几种方法的比较

食品中亚硝酸和硝酸盐检测的方法很多，各有利弊。吸光光度法所用仪器设备简单、价廉，灵敏度也较高，实用性和可操作性强，易于在基层单位使用。紫外分光光度法的优点是不经分离可直接同时测定硝酸盐和亚硝酸盐，具有较好的选择性，操作简便。荧光分析法不受检测液本身颜色和混浊及样品稀释度的干扰，但操作较复杂，对环境因素敏感，适用范围不广。镉柱法结果准确，但是操作复杂，时间较长，不适宜大批量样品的检测，且其还原剂镉对环境构成很大威胁。色谱法测定准确，但是测定速度一般，且需昂贵的仪器。离子色谱法具有高灵敏度、选择性好、操作步骤简单、无污染等优点，适合广泛推广和应用。离子选择电极法快速、简便，测定硝酸根的线性范围较宽，是普通比色法所不能比的，但是该法费用较高，影响结果准确性的因素较多。极谱法灵敏度较低。