乙肝病毒YMDD基序变异的分子生物学检测方法 |
| 作者： 更新时间：2007-11-30 16:05:13 |
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| 乙肝病毒YMDD基序变异的分子生物学检测方法 卜范峰 鲁艳芹* 韩金祥（山东省医药生物 技术研究中心 国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东省现代医用药物与技术重点实验室 济南 250062）摘要 拉米夫定治疗乙肝六个月以上就会产生耐药性，这与HBV YMDD基序变异有关。目前检测YMDD变异的分子生物学方法主要有直接测序法、限制性片断多态性分析（RFLP）、5’－核酸酶检测法、基因芯片法、实时定量PCR、焦磷酸测序（Pyrosequencing） 技术、高效变性液相色谱法（DHPLC）等。关键词：拉米夫定；YMDD基序变异；YIDD；YVDD； 突变检测中图分类号：Q33 拉米夫定是目前临床上常用的治疗乙肝的一种药物。如果应用该药六个月以上，HBV P基因区YMDD 基序即酪氨酸（Y）一蛋氨酸(M)一天门冬氨酸(D)一天门冬氨酸(D)中204位点（M）蛋氨酸被（V）缬氨酸或（I）异亮氨酸取代，生成YVDD或YIDD、，从而产生耐药性[1][2].。在204位点发生突变的同时常会出现180位点的联合突变[2][3]。拉米夫定耐药后会使病人血清DNA升高，甚至使病人的病情恶化。因此建立简单、快速的检测拉米夫定治疗前及治疗过程中YMDD变异情况的方法可以及时、尽早发现变异，从而调整用药和治疗方案，这对于控制疾病的进程和促进临床治疗是非常有意义的。 1.检验方法： 1.1直接测序法 DNA 测序法一直被认为是检测基因突变的金标准。因为这种方法准确性、敏感性高，所以在单核苷酸多态性的研究中一直被广泛应用。国内外很多学者都曾利用直接测序法或结合其他方法检测HBV YMDD基序变异： Yang DH等[4]就利用直接测序和RFLP相结合的方法对35名HBV DNA阳性的病人进行了检测，发现14人的血清HBV DNA发生了YMDD突变，其中YIDD 4例，YVDD 6例，YIDD和YVDD混合型1例，这些监测结果经过RFLP检测和直接测序法互相验证，两种方法检测结果是完全相符的。LIU KZ等[5]用直接测序法对63位慢性乙肝病人进行了YMDD突变的检测，发现其中26人发生了rtL180M/M204V突变，14人发生了rtL180M/M204I，18人发生了rtM204I，还有5人只有rtL180M。虽然直接测序法在YMDD检测中被应用广泛，但其不足之处是这种方法费时、费力并且费用相对于其他方法也比较高。所以，测序法不适合于临床大规模检测乙肝病毒YMDD基序变异。 1.2 基于PCR的限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术和5’核苷酸酶检测法 利用限制性内切酶对DNA特定序列专一性识别并进行切割的特点，对目的DNA进行酶切，则不同的序列就会被切割成长短不一的DNA片断，再通过凝胶电泳观察酶切结果，然后对酶切图进行多态性分析，这种方法就是限制性片断长度多态性分析法（RFLP）。Marchelle I等[6]用RFLP分析法对50份乙肝病人用拉米夫定后的血清标本进行了检测，并与直接测序的结果进行比较发现：RFLP较直接测序法可以对血清样本进行大规模的检测；在检测野生株和突变株混合型样本时RFLP比直接测序法更敏感。Chieochansin T等[7]运用错配引物引入酶切位点，再用RFLP检测77份血清，除了28份不能被扩增，15份不能被分类以外，13份被鉴定为野生型，2份被鉴定为YIDD突变，2份被鉴定为YVDD突变，11份为YMDD和YIDD突变混合型，5份为YMDD和YVDD突变混合型，1份为YIDD和YVDD突变混合型。还有不少学者[8][9]运用PCR－RFLP方法对乙肝病人用拉米夫定后HBV DNA YMDD变异情况进行了检测。 5’－核酸酶检测法是一种基于PCR反应的检测技术，它是利用DNA Taq酶5’－3’外切酶活性在PCR扩增过程中切割结合在DNA5’末端的杂交探针（探针的5’端带有荧光报告基因，3’端带有淬灭基因），只有当探针与DNA模板互补结合时才能被5’核酸酶切割。在进行PCR反应过程中当上游引物延伸时，探针就会被切割，从而发出荧光，荧光的强弱可以被荧光计所定量。当荧光探针与DNA模板因为碱基不同不相互补时，探针不会被切割，也就不会发出荧光信号。因此，通过检测每一种荧光的特定发射光谱就可以知道DNA是否存在以及它的序列。在检测等位基因的时候，两种具有不同碱基序列、带有不同的荧光染料的探针（比如野生型和突变型序列）结合在模板DNA5’端，用于PCR扩增以鉴别特定的DNA序列，即使这段序列只有一个碱基的差别，也能通过这种方法检测到[6]。MarchelleI等[6]就运用这种方法结合RFLP法对50例乙肝病人用拉米夫定后血清DNA YMDD突变情况进行了检测。实验证明这种方法检测基因突变也很灵敏，但是5’－核酸酶检测法在对低浓度病毒量和混合型病毒株的检测方面不如限制性片段长度多态性分析法更灵敏。但是以上两种方法操作步骤比较复杂，且检测结果受很多方面的影响，因此也不能满足临床大规模、快速、准确检测的需求。 1.3基因芯片技术 该技术基于碱基互补原理，在固体芯片表面按一定的阵列集成大量的基因探针，然后与待测的有荧光标记的样品核酸进行杂交反应，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取样品分子的数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的分析。 目前，许多研究人员将基因芯片技术应用于基因突变的检测。Heo J等[10]人利用基因芯片技术对40例未曾应用过拉米夫定治疗的慢性乙肝病人的血清进行检测，其中7名病人血清HBV DNA发生了YMDD变异，在这7名病人中又有3人是YMDD和YIDD混合型。Jang H等[11]人运用寡核苷酸芯片对123名接受过拉米夫定治疗的慢性乙肝病人进行了检测，其中有80名病人的血清中HBV DNA发生了YMDD变异，在这80份样品中17份样品是YVDD（rtM204V），24份是YIDD3（rtM204I3）,3份是YIDD2(rtM204I2)，36份样品是混合型突变。利用寡核苷酸芯片对YMDD监测结果与RFLP检测结果符合率为96.7％，对rtL180位点的检测与测序的结果符合率为100％，因此可以认为寡核苷酸芯片技术对于检测耐药乙肝病毒是可靠和有用的一种工具。扬守平等[12]人对应用拉米夫定治疗6-19mo 的25 例ALT 异常的慢性乙肝患者进行耐药基因芯片检测，25 例中，HBVDNA 阴性4 例，21 例阳性，检出HBVYMDD 变异5 例, 其中YVDD变异＋L180M 共生3 例，YVDD 共生2 例，野生株16 例检出率为23.8％。 1.4荧光定量PCR 荧光定量PCR检测突变具有快速、准确的特点。Wang RS等人[13]建立了一种利用通用模板和TaqMam探针的方法进行荧光定量PCR检测YMDD突变的方法:YIDD和YVDD突变的检测分别进行PCR扩增（V反应和I反应）,另一个反应C作为对照,根据△CT＜3.5进行结果分析（△CT＝CT(V)或者CT(I)-CT(C)），他们用这种检测方法对163例用拉米夫定治疗一年到两年的慢性乙肝病人的血清进行了检测并通过测序进行验证。检测结果显示：163份样本中112份为YMDD，21份为YIDD，27份为YVDD,还有3份是YIDD和YVDD混合型。其中用拉米夫定治疗一年的病人中有19％（73人中14人被检出）进行了两年拉米夫定治疗的病人中有40％被检出突变（90人中37人被检出）。另外不少其他学者也利用荧光定量PCR检测乙肝病毒突变， Punia P等[14]利用ARMS（the amplification refractory mutation system）引物和实时定量PCR进行YMDD突变的检测并与DNA测序法比较，结果显示他们的实验方法更能快速、敏感的定量检测和监测与拉米夫定耐药有关的HBV YMDD突变。Yu A等[15]也对荧光定量PCR在大量DNA库中检测SNPs及在HBV DNA YMDD突变的检测中的利用进行了有意义的探索。Yang ZJ 等[16]比较了测序、Pyrosequencing和real-time PCR法检测突变发现实时定量PCR检测YMDD突变效果好并且更省时、敏感性更强。由于荧光PCR法检测突变快速、准确，现在已广泛应用于HBV YMDD变异的临床检测。但是，这种方法也存在费用相对较高的缺点。 1.5Pyrosequencing 技术焦磷酸测序(Pyrosequencing )[16][17][18]技术是一种新的DNA 序列分析技术。此技术是由4 种酶即DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。反应底物中还有荧光素，反应体系还包括待测序DNA 单链和测序引物。在测序反应中，首先加入一种dNTP，如果它正好和模板DNA的下一个碱基配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。释放出的PPi和底物中的APS在ATP硫酸化酶的作用下生成ATP，继而ATP又和荧光素在荧光素酶的作用下生成氧化荧光素，并发出可见光，并由PyrogramTM 转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。与此同时，反应体系中剩余的dNTP 和残留的少量ATP 在双磷酸酶Apyrase 的作用下发生降解，这样就可以加入另一种dNTP继续上面的反应[18]。反应完成后根据生成的峰值图就可以得到DNA序列信息。这种技术操作简单，结果准确可靠，可应用于HBV YMDD突变的检测。Anna Lindstro¨m等[19]运用焦磷酸测序技术对拉米夫定耐药病人的血清进行了YMDD突变的检测，并与直接测序法进行比较，发现两种方法对于YMDD突变的检测都非常敏感，准确率都很高。但是，在对突变和野生的混合株进行检测的时候发现，直接测序法不如焦磷酸测序技术灵敏，在人为的野生型和突变型病毒的混合物中（80％野生型病毒，20％为突变型病毒），这两种方法都可以检测到突变的存在，但是对于野生和突变片断之间的比例的测定与已知的数据符合率要高于直接测序法。而在检测另一种情况的野生和突变混合物（野生型占20％，突变型占80％）时Sanger 测序不能检测到野生型病毒，而pyrosequencing 仍然能够准确地检测到野生型病毒的存在。焦磷酸测序技术在其他方面也优于直接测序法，比如：焦磷酸测序技术相对于Sanger测序更快速，它可以用十分钟左右的时间对96份样品进行测序.对待测样品的准备和处理所用时间比Sanger测序要少得多并且过程更简单。然而焦磷酸测序技术只能检测大约40bp左右的碱基，而传统的测序技术可以对500bp长的碱基进行检测，在这一方面前者不如后者。综上所述，pyrosequencing更适合于大规模的检测已知突变位点的检测，而不适于对大范围基因突变的筛选。这一点正好符合对HBV YMDD突变的检测要求，因此可以成为临床检测和科学研究的一个有利工具。 1.6变性高效液相色谱法检测YMDD突变变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）是一种新的高通量、自动化的基因突变检测技术。这一技术最先由Oefner 等[20] 于1995 年建立，现在普遍使用的是美国Transgenomic 公司开发的WAVE核苷酸片段分析系统，它通过一个独特的DNA 色谱柱-DNASep 柱进行核酸片段的分离和分析。其原理是用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链，DHPLC进行基因突变检测是基于异源双链的形成，当检测基因突变时，先把野生型和突变型PCR产物等比例混合，在部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同源双链，同时也错配形成异源双链，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离[21]。完全匹配的同源双链除溶剂峰、引物峰和杂质峰外, 在目标产物处应出现一个单峰, 且峰的对称参数应接近于1, 如峰数超过一个, 或出现肩峰及不对称峰, 则表明存在匹配的异源双链, 异源双链将被测序以识别可能的突变位点[22]。根据这一原理，可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析等。要想成功的利用DHPLC检测突变要注意四个方面：（1）.PCR引物的设计（2）PCR条件控制（3）分离梯度（4）分离温度[23]。DHPLC检测基因突变具有：快速、准确、高通量、经济、操作简单、PCR产物不需进行纯化处理及全自动操作等特点。韩伟、施锦绣等[24][25]就曾利用DHPLC技术进行了单核苷酸多态性的检测。陈发林等[26]先筛选出21例HBV DNA阳性的慢性乙肝病人，然后运用荧光PCR法结合DHPLC法检测乙肝病毒 YMDD变异，结果显示：21例中10例为野生型，8例发生YIDD变异，3例发生YVDD变异。 DHPLC检测结果显示野生型YMDD的DHPLC图形呈单峰，而变异型YIDD、YVDD的DHPLC图形呈现三峰，且峰型低矮、宽大、与野生型YMDD的DHPLC图形明显不同。DHPLC检测结束后对于出现异常峰型的样本进行测序确定发生了哪种类型的变异。DHPLC技术还被用来进行各种疾病相关基因突变或SNPs的筛选、检测等[27][28][29]。作为一种新的能够大规模快速检测基因突变的新技术，DHPLC与DNA直接测序等突变检测技术相比，具有灵敏性更高，特异性更强，廉价省时等优点[30]。但是，DHPLC对检测样本的PCR扩增要求比较高，不但有PCR引物设计、PCR条件控制、扩增片断最适长度的要求，还对扩增产物的特异性有较高要求。PCR扩增特异性差时，会导致假阳性，以致检测失败。 2.展望目前已有不少分子生物学检测技术出现，但是都存在着一些的缺点，不是费用高，就是操作复杂、技术难度高，或者不适合于大规模的应用。因此，现在临床上更需要一种既快速、准确、成本低、易于操作，又适于临床大规模检测样本的方法。这也要求科研人员不断的创新来改进、发明一些新技术，使其更适合于实际应用。 参考文献 [1] Bartholomeusz, A., and S. A. Locarnini. 1997. Mutations inthehepatitis Bvirus polymerase gene that are associated withresistance to famciclovir andlamivudine. Int. Antiviral News 5:123–124. [2] Niesters, H. G., P. Honkoop, E. B. Haagsma, R. A. de Man, S. W. Schalm,and A. D. Osterhaus. 1998. Identification of more than one mutation in thehepatitis B virus polymerase gene arising duringprolonged lamivudine treatment.J. Infect. Dis. 177:1382–1385. [3] Li MW. Hou W. Wo JE. Liu KZ.Character of HBV (hepatitis B virus) polymerase gene rtM204V/I and rtL180M mutation in patients with lamivudine resistance.J Zhejiang Univ Sci B. 2005 Jul;6(7):664-7. [4] Yang DH. Liang WF. Xie YJ. ZhaoNF. Fan J. PCR restriction fragment length polymorphism in detection of YMDD variants of viral polymerase in hepatitis B virus patients treated with lamivudine. Hept obiliary Pancreat Dis Int. 2002 May;1(2):232-7. [5] Liu KZ. Hou W.Zumbika E. Ni Q. Clinical features of chronic hepat-itis B patients with YMDD mutation after lamivudine therapy.J Zhejiang Univ Sci B. 2005 Dec;6(12):1182-7. [6] Aleen MI. Gauthier J. DesLauriers M. Bourne EJ. Carrick KM. Baldanti F. Ross LL. Lutz MW.Condreay LD. Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine. J Clin Microbiol. 1999 Oct;37(10):3338-47. [7] Chieochansin T.Chutinimitkul S. Payungpom S.Theamboonlers A.Tangkijvanich P. Komolmit P. Poovorawan Y. Rapid detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutations by PCR-based methods.Tohoku J Exp Med. 2006 Sep;210(1):67-78. [8] Pei F. Ning JY. You JF. Yang JP. ZhengJ. YMDD variants of HBV DNA polymerase gene: rapid detection and clinicopathological analysis with long-term lamivudine therapy after liver transplantation. World J Gastroenterol. 2005 May 14;11(18):2714-9. [9] Shin YM. Heo J. Kim GH. Kang DH. Song GA. Cho M. Yang US. Kim CM. Park HK. Jang HJ. Natural YMDD motif mutations of HBV polymerase in the chronic hepatitis B virus infected patients .Taehan Kan Ha khoe Chi. 2003 Mar;9(1):1-9. Korean. [10] Heo J. Cho M. Kim HH. Shin YM. Jang HJ. Park HK. Kim CM. Kim GH. Kang DH. Song GA. Yang US. Detection of YMDD motif mutants by ol igonucleotide chips in lamivudine-untreated patients with chroni c hepatitis B virus infection. J Korean Med Sci. 2004 Aug;19(4): 541-6 [11] Jang H, Cho M, Heo J, Kim H, Jun H, Shin W, Cho B, Park H, Kim C. Oligonucleotide chip for detection of Lamivudine-resistant hepati tis B virus.J Clin Microbiol. 2004 Sep;42(9):4181-8. [12] 杨守平，胡德昌，郑可飞，孙小兵，陶维玉，马宁.基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中HBVYMDD 变异25 例.世界华人消化杂志2002;10(9):1067-1068 [13] Wang RS. Zhang H. Zhu YF. Han B.Yang ZJ.Detection of YMDD mutants using universal template real-time PCR.World J Gastroenterol. 2006 Feb 28;12(8):1308-11. [14] Punia P. Cane P. Teo CG.Saunder N.Quantitation of hepatitis B lamivudine resistant mutants by real-time amplification refractory mutation system PCR.J Hepatol. 2004 Jun;40(6):986-92. [15] Yu A. Geng H. Zhou X. Quantify single nucleotide polymorphism (SNP) ratio in pooled DNA based on normalized fluorescence real-time PCR.BMC Genomics. 2006 Jun 9;7:143. [16] Yang ZJ. Tu MZ. Liu J. Wang XL.Jin HZ. Comparison of amplicon-sequencing, pyrosequencing and real-time PCR for detection of YMDD mutants in patients with chronic hepatitis B.World J Gastroenterol. 2006 Nov 28;12(44):7192-6. [17] Pourmand N, Elahi E, Davis RW, Ronaghi M. Multiplex Pyrosequencing.Nucleic Acids Res. 2002 Apr 1;30(7):e31. [18] Agah A, Aghajan M, Mashayekhi F, Amini S, Davis RW, Plummer JD, Ronaghi M, Griffin PB.A multi-enzyme model for Pyrosequencing.Nucleic Acids Res. 2004 Dec 2;32(21):e166. [19] Lindstrom A, Odeberg J, Albert J. Pyrosequencing for Detection of Lamivudine-Resistant Hepatitis B Virus .J Clin Microbiol. 2004 October; 42(10): 4788–4795. [20] Oefner PJ, Underhill PA. Comparative DNA sequencing by denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Am J Hum Genet,1995, 57(Suppl): A266. [21] X IAO W , OEFN ER P J. Denaturing h igh performance liquid chromatography: a review [J ]. Hum Mutat, 2001,17 (6) : 439- 474. [22] Gallo A, Thomson E, Brindle J et al. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Res, 2002, 30:3945 [23] Donohoe E. uring high-performance liquid chromatography using the WAVE DNA fragmentanalysis system.Methods Mol Med. 2005;108:173-87. [24] 韩伟，楼定华，王竞，Sheaping Yip, Maurice Yap.高效液相色谱分析法在人类基因组单核苷酸多态性检测中的应用.浙江大学学报（医学版）2005；34（3）248－254 [25] 施锦绣，杨爽，姜正文，江宏铨，陈天瑜，陈竺，黄薇.变性高效液相色谱与直接测序法在单核苷酸多态性检测中的应用比较.中华医学遗传学杂志2001；18（3）198－201. [26] 陈发林，郭永建，伍严安，黄毅，马晓宁，黄肖利.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒 YMDD 变异的研究.中华检验医学杂志 2006；29 （11）：980－983 [27] Yu B, Sawyer NA, Caramins M, Yuan ZG, Saunderson RB, Pamphlett R, Richmond DR, Jeremy RW, Trent RJ.Denaturing high performance liquid chromatography: high throughput mutation screening in familial hypertrophic cardiomyopathy and SNP genotyping in motor neurone disease.J Clin Pathol. 2005 May;58(5):479-85. [28] Tester DJ, Will ML, Ackerman MJ. Mutation detection in congenital long QT syndrome: cardiac channel gene screen using PCR, dHPLC, and direct DNA sequencing.Methods Mol Med. 2006;128:181-207. [29] Ferlin A, Vinanzi C, Garolla A, Selice R, Zuccarello D, Cazzadore C, Foresta C. Male infertility and androgen receptor gene mutations: clinical features and identification of seven novel mutations. Clin Endocrinol (Oxf). 2006 Nov;65(5):606-10. [30] Jones A C，Sampson J R，Cheadle J P，Low Level Mosaicism Detectable by DHPLC But Not by Direct Sequencing．Human Mutation，2001，17 ：233- 234 The molecular biology methods for detection of YMDD mutations in HBV BU Fan- feng LU Yan -Qin HAN Jin- Xiang Shandong medical biolechnology center Key laboratory of the Biotechdrugs ,Ministry of health., Key Laboratory of Modern Medicine and Technology of Shandong Province jinan 250062 china Abstract : Drug-resistant occurs after patients with chronic hepatitis B (CHB)have received lamivudine therapy more than six monthes. That is because of mutations of the YMDD motif.At present, molecular biology methods for detection of YMDDmutations contain:direct-senquencing, restriction fragment length polymorphism (RFLP)，5’-nuclease assay，gene Chip，real-time PCR，Pyrosequencing biotechnology，Denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)and so on. Key words: Lamivudine；YMDD mutations ； YIDD ；YVDD ；Mutations Detection |
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