两种纯化方法在流感病毒中的比较研究 |
| 作者： 更新时间：2007-11-30 16:14:28 |
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| 流行性感冒是指一种流感病毒（Influenza virus）引起的高感染率的急性呼吸道传染病，每年都能在世界范围内发生高致病率和死亡率[1]。流感病毒（Influenza virus）是单链的RNA病毒[2]，直径80～120nm,分子量为4～5×106[1]，被含有两种糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶（neuraminidase ；NA）的囊膜覆盖着。这些糖蛋白特别是血凝素(HA)，在自然感染和接种疫苗时都能在对流感病毒的宿主反映中作为关键的抗原被识别[2] [3]。尽管流行性感冒的危害性非常严重，但目前尚无特效药可治，只有及早接种流感疫苗来防止流感的发生。因此为了满足这种潜在的流行性感冒流行的挑战，建立一种可靠的、有效的下游纯化技术是必要的[4]。目前常用于疫苗生产的病毒纯化方法有蔗糖密度梯度离心法和凝胶层析法，比如文献中报道的凝胶层析法制备乙型脑炎疫苗（地鼠肾细胞）[5]，双价肾综合征出血热纯化疫苗（Vero细胞）[6]等采用了凝胶层析法；乙型脑炎疫苗（Vero细胞）[7]，乙型脑炎疫苗（地鼠肾细胞）[8]等采用了蔗糖密度梯度离心法，结果表明这两种方法在杂蛋白去除率、抗原回收率等方面均达到了较好的效果。流感疫苗的病毒纯化方法也不外乎这两种，但对两者的纯化效果如纯度和收率等尚无确切的实验数据比较。作者针对这一特点，对两种纯化方法进行了大量的摸索、研究，最后通过对纯化后病毒液的质量分析，建立了切实可行的纯化手段，并对两种纯化方法进行了比较。 1 材料与方法 1.1 材料流感病毒毒种、流感病毒标准抗原及流感病毒标准抗血清均购自于NIBSC（英国国家生物制品检定所）；SPF鸡胚购自北京实验动物研究中心；普通鸡胚购自大连大山种鸡厂；Serazym Ovalbumin ELISA 试剂盒购自Seramun Diagnostica GmbH（代理商：北京威正盛达科技发展有限公司）；牛血清白蛋白标准品购自中国生物制品检定所；蛋白纯化仪（AKTA explorer100，Pharmacia公司）；超速离心机（CP70MX, 日本日立公司）。 1.2 方法 1.2.1 构建毒种库 取一支冻干流感毒种(NYMC X-147 E9 03/204)，用灭菌蒸馏水稀释至10-2，接种11日龄的SPF鸡胚，经34.8℃培养48小时后，放入4℃冷胚24过夜，次日收获其尿囊液，经检定后，符合要求的作为毒种库。 1.2.2 单型病毒原液的制造 取工作毒种库中的一支，稀释度10-2，接种于11日龄的普通鸡胚，经34.8℃培养48小时后，放入4℃冷胚24过夜，次日收获其尿囊液，分别对不同批次的尿囊液进行检测，其血凝滴度大于1：240的原液混合，用于超滤浓缩。 1.2.3 超滤浓缩 将单型病毒原液经10µm粗率后，再经3µm、0.45µm、0.22µm过滤，最后用300KD的膜包进行超滤浓缩约50倍。 1.2.4 分离纯化 1.2.⒋1Sepharose 4FF凝胶层析：平衡缓冲液为0.01M PBS , pH 7.5；洗脱缓冲液为0.01M PBS , pH 7.5; 流速1.0ml/min；压力 0.28MPa；收集洗脱峰。 1.2.⒋2蔗糖密度区带离心：蔗糖浓度为30%；55%；进样转数为3000rpm；进样时泵流速为50—100ml/min；离心条件为30000rpm，3小时；收集目的峰。 1.2.5 ELISA法测定卵清蛋白含量 先将每孔加入100μlHRP标记的抗体，再分别加入100μl稀释后的样品、标准工作液（0.31ng/ml、0.625 ng/ml、1.25 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml）及对照样品，37℃孵育60分钟后，洗板5次，每孔再加入100μlTMB底物液，22—25℃孵育10分钟，每孔加入100μl终止液，用酶标仪检测450/620nm OD值。 1.2.6 单放射免疫扩散法测定血凝素含量 琼脂糖扩散板的制备：将100μl抗体加入到浓度为1.5%、56℃的琼脂糖中，打孔：每孔直径为3mm；每孔边距为6mm；样品裂解：将待检样品、标准品及对照品用10%的Zwittergent-degent3-14裂解剂，室温裂解40分钟；加样：每孔加入样品15μl；24小时扩散后，PBS浸泡2小时；晾干后，用0.5%考马斯亮蓝色10分钟，脱色后观察结果。 1.2.7 总蛋白测定 采用Lowry法测定（按《中国药典》三部2005版）。 1.2.8 内毒素测定 采用鲎试剂法测定（按《中国药典》三部2005版）。 2 结果 2.1 毒种库的建立及检定将一支来源于NIBSC的冻干毒种在鸡胚上传代扩增制备了主毒种库和工作毒种库，并对毒种库毒种进行了常规检定，结果（见表1）均符合要求，可作为疫苗生产用毒种。表1毒种库的检定检测项目 血凝滴度 EID50 鉴别试验 无菌试验主毒种 1：320 7.2 阳性 阴性工作毒种 1：480 7.6 阳性 阴性 2.2 单型病毒液的制造一支工作毒种接种400枚以上普通鸡胚为一批病毒原液，共制备了10批原液，选择血凝滴度在1：240的8批混合后用于超滤浓缩,浓缩倍数为50倍。 2.3 分离纯化 2.3.1 Sepharose 4FF凝胶层析 收集洗脱峰1，2经血凝滴度和鉴别试验确认流感病毒主要集中在洗脱峰1中。 1 3 5 7 2 4 6 8 图1 鉴别试验鉴定纯化后流感病毒 Fig.1 Diagnosis test Identification of Influenza virus purified 1、2：:minus comparison；3：masculine comparison；5，7：1，2 peak of Sepharose 4FF agrose; 4，6，8：1，2 ，3 peak of gradient centrifugation。 图2 流感病毒Sepharose 4FF凝胶层析图 Fig.2 Sepharose 4FF agrose chromatography profile of Influenza virus 2.3.2 蔗糖密度区带离心 收集洗脱峰1、2、3经血凝滴度和鉴别试验确认流感病毒主要集中在洗脱峰3中。 图3 流感病毒蔗糖密度区带离心图 Fig.3 Gradient centrifugation profile of Influenza virus 2.4 纯度比较目前生物制品对病毒纯度还没有统一的标准，这样给病毒的纯化和对纯度的评价带来了一定的困难，无法对纯化效果和不同的纯化方法进行评价。作者尝试用血凝素（HA）含量和蛋白浓度的比值作纯度标准，对层析法和离心法的病毒峰的纯度进行了比较[9]。结果：浓缩后未纯化病毒HA含量为328.5ug/ml ，蛋白含量为2383.9ug/ml，将两者比值作纯度指标，纯度为0.138； 蔗糖梯度离心纯化后为HA含量为189.3ug/ml, 蛋白含量为374.1 ug/ml，纯度为0.506；层析纯化后HA含量为42.1ug/ml，蛋白含量为82ug/ml, 纯度为0.513； 1 3 5 7 9 2 4 6 8 10 图4 SRID试验检测血凝素（HA）含量结果图 Fig.4 Result profile of HA content determination for SRID test 1、2: two parallel concentrated samples ;3、4: two parallel purified samples of gradient centrifugation; 5、6: two parallel purified samples of sepharose 4FF agrose ;7、8、9、10：the standard samples of 3/4 original multiple，1/4 original multiple，original multiple，2/4 original multiple 2.5 卵清蛋白的比较纯化前卵清蛋白含量为25.46ug/ml，纯化后凝胶层析和密度梯度离心分别为0.11ug/ml、0.89ug/ml，其去除率分别为99.5% 、97.5%。卵清蛋白含量的超标是当前流感疫苗中引起人体幅反应发生的主要原因之一，因此应严格控制其含量。从试验结果可以看出，两种方法纯化后卵清蛋白含量均达到WHO规定要求，但凝胶层析方法要稍好于梯度离心法。 2.6 病毒回收率蔗糖梯度离心法和凝胶层析法的回收率分别为42%和38.7%。 2.7 其它纯度指标蔗糖梯度离心法和凝胶层析法的杂蛋白去除率分别为88.7%和89.7%；在内毒素去除方面并无差别，其含量均小于200EU/ml。 3 讨论疫苗分离纯化方案的选择不仅影响产品的质量和成本，而且也决定其产量。因此在疫苗的实际生产过程中，应从质量要求、产物特性、纯化方法的技术特点、成本等多方面考虑，选择合适的纯化方法[10]。目前，国内外有多个厂家生产流感疫苗，其制造方法大同小异，各有所长，但病毒纯化的方法主要有密度梯度超速离心和凝胶层析两种。作者根据现有条件及国内外疫苗的相关纯化方法，经过多次调整设计和试验，初步确定了密度梯度离心和凝胶层析的方案，使流感病毒与收获液其他组分（如脂蛋白、卵清蛋白等）、得到了较好的纯化。并对两种方法的纯度和收率进行了比较，从试验结果可以看出两种纯化方法均可以获得较好的纯度和收率。若从产业化的角度考虑，因密度梯度离心法的病毒回收率要好于凝胶层析法，采用密度梯度离心法制备流感疫苗会节缩成本，但用该法纯化流感病毒的纯度不如凝胶层析法，不过这种问题可以通过对梯度离心的中后部的收样的减少来调整。由于试验中用于纯化的病毒液样品全部来自本实验室自己制备，样品量有限，所以未能得出调整后可能的纯度、收率等相关检测数据，同时对于流感病毒纯化后病毒液的裂解 |
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