一 化学键合、化学吸附色谱固定相

1．键合相色谱固定相

大部分基质是3,5或10μm粒径的多孔微粒硅胶，用0.1mol·L-1HCl加热处理1-2d使表面完全水解生成可进行键合反应的硅轻基。这种硅胶表面硅羟基浓度8.0±1.0μmol/m2。键合固定相最有用的制备方法是硅胶表面硅羟基和有机硅烷进行硅烷化反应，形成比较稳定的一Si-O-Si-C一结构，典型反应如下：

式中X为氯或甲氧基、乙氧基，R为烷基、取代烷基或芳基、取代芳基。由于空间位阻硅烷化反应的表面键合量一般在4fcmol/m'或更低。未反应的SiOH给表面带来不利的残留极性作用，引起色谱峰拖尾，特别是对碱性溶质。为了消除这种影响，可用三甲基氯硅烷进一步硅烷化封尾反应，因为它体积小，能键合残留的一SiOH。

根据R的结构不同，可分为非极性键合相和极性键合相。非极性键合相的R为烷基或芳基，如C1,C4，C6，C8，C18，C22等不同链长烃基和苯基键合相；极性键合相R中引入氰基、羟基、氨基、卤素等，如-C2H2CN，-C3H6OCH2CHOCH2OH,-C,H,NHZ,-C,H,NHCH,NHZ,-C3H,Cl等。这些键合相均已商品化，其中十八烷基键合硅胶（octadecylsilica,ODS或C18）应用最广。硅胶键合固定相热和化学稳定性好，耐溶剂，不吸水，可在pH2-8水溶液流动相中长期工作。

键合固定相的性能指标有：(1)键合量：可以键合硅胶含碳量和表面覆盖率表示，其含碳范围5%-40%，表面覆盖率1-4μmol/m2。(2）按某指定k值溶质测定的理论塔板数。(3)色谱柱渗透性，可以柱前压度量。(4)两种不同溶质的分离选择性a。(5）保留值k的重现性。(6)色谱峰的对称性。(7)稳定性：耐溶剂和pH范围。

根据色谱体系固定相和流动相相对极性，可分为反相和正相键合相色谱。非极性或烃基键合相和水、乙腈(CAN)、甲醇(MeOH）等极性溶剂为流动相构成的反相色谱体系，是当今最重要、应用最广泛的反相色谱方法，估计高效液相色谱常规分析工作约70％采用这种色谱方法。高效液相色谱中反相色谱已成为非极性键合相色谱的同义语。

极性键合相和正己烷、二氯甲烷等非极性、弱极性溶剂构成正相色谱体系；而以水为主加甲醇、乙腈等极性溶剂的流动相构成反相色谱。因此极性键合相视流动相类型可分别形成为正相或反相色谱方法。

2．化学吸附改性色谱固定相

其典型代表是新近以微粒氧化锆、氧化锆／氧化镁等为基质，通过Lewis酸碱化学吸附作用，制备长链烷基麟酸（C8-C18）及含极性基团衍生物的非极性和极性色谱固定相。它们具有耐溶剂、耐酸碱(pHl-12)、化学稳定和适用范围广的特点，其色谱性能与键合硅胶固定相基本类似，而制备简便、适用碱性化合物、蛋白质等生物试样分离，是一类极具发展潜力的新型HPLC固定相。

二 键合相色谱保留机理

反相色谱溶质保留类似于从水中萃取有机化合物至有机溶剂（如辛醇），非极性疏水化合物更易于萃取至非极性固定相中，非极性化合物保留较强；亲水性极性化合物保留较弱。疏水效应是当今较为公认阐明反相色谱保留机理的理论依据。以色散为主的非极性分子间作用力很弱，烃类键合相具有长链非极性配体，在固定相基质表面形成一层“分子刷”，在高表面张力水溶性极性溶剂环境中，当非极性溶质或其分子中非极性部分与非极性配体接触时，周围溶剂膜会产生排斥力促进两者缔合。这种作用称为“憎水”、“疏水”、“疏水效应”或“疏溶剂效应”。溶质保留主要不是由于溶质与固定相之间非极性相互作用，而是由于溶质受极性溶剂的排斥力，促使溶质（s）与键合非极性烃基配体(L)发生疏溶剂化缔合，形成缔合物（SL)，导致溶质保留。这种缔合是可逆的：

S十L↔SL

缔合作用强度和溶质保留决定三个因素：溶质分子中非极性部分的总面积；键合相上烃基的总面积；影响表面张力等性质的极性流动相性质和组成。

疏溶剂理论能很好解释高含水量流动相反相色谱溶质保留行为，然而烃基键合相表面不很均匀，在一定条件下，主要是流动相含水量不高时，表面残余硅羟基对极性溶质保留起一定作用。因而溶质保留除疏水作用外还存在残余硅羟基作用，即双保留机理。随着键合相制备和反相色谱技术发展，键合相表面均匀性提高和流动相改进，残余硅羟基作用已大大降低至可以忽略。

极性键合相的正相色谱保留主要基于固定相与溶质间的氢键、偶极等分子间极性作用。如胺基键合相兼有质子受体和给予体双重功能，对可形成氢键的溶质具有极强分子间作用，导致保留值k升高和较好分离选择性。极性键合相反相色谱体系，由于固定相的弱疏水性和极性作用而显示双保留机理，何者占优势则取决于流动相水一有机溶剂类型和组成及溶质结构。

三 反相色谱分离条件优化

极性键合相正相色谱操作条件优化与吸附色谱相似。这里主要讨论影响非极性键合相反相色谱保留值因素和分离条件优化。

1．固定相选择

改变非极性键合相烃基链长和键合量，链长增加导致溶质保留值k升高，但长链之间k和a差别较小，相同表面覆盖率C18柱保留值略大于C8柱。因此大多数选用ODS柱（一般ODS含碳约为10%，相当于硅胶表面覆盖率1μmol/m2)。键合量增加，k上升。表面覆盖率＜3μmol/m2,1gk与覆盖率呈线性关系，且不管链长为C4或C18，即与链长关系不大。

取代烃基键合相疏水性一般比烃基键合相弱，苯乙烯／二乙烯苯交联共聚物微球等非极性有机固定相疏水性比键合相更高。非极性、非离子性化合物的反相色谱保留值一般随固定相遵循以下顺序：
未改性硅胶（弱）《胺基＜氰基＜羟基＜醚基＜C1<C3<C4＜苯基＜C8≈C18<聚合物（强）改变色谱固定相或色谱柱通常不如改变流动相溶剂类型和组成有效，只有在改变流动相不成功时，才尝试改变柱类型提高分离选择性以实现需要的分离。

2．流动相选择

改变流动相溶剂性质和组成，这是调节k和选择性a最简便有效的方法。反相色谱均采用水和水溶性极性溶剂为流动相，改变流动中有机溶剂（B%)/水(A%）体积配比获得需要的溶剂强度，可调节k和a值；改变有机溶剂类型亦可改变k和a值。调节流动相组成以获得所需k值可采用上述式子计算。

文献的数据表明反相色谱使用的溶剂强度顺序为：水（0，最弱）＜甲醇（3.0)＜乙腈(3.1)＜丙酮(3.4)＜二氧六环（3.5)＜乙醇(3.6)＜异丙醇(4.2)＜四氢呋喃（4.4)＜丙醇(4.5)＜二氯甲烷（最强），括号中数据为反相色谱相对强度S。可见反相色谱溶剂强度随P’降低而增加。流动相中有机溶剂（B)增加，k下降，B增加10%,k降低2-3倍，1gk与B％基本成线性关系，这是色谱固定相反相色谱性能的重要特征。欲保持溶剂强度基本不变，以溶剂C置换溶剂B来改变分离选择性，其含量按下式计算：

φC＝φB(SB/SC)

式中SB,SC为溶剂B,C的反相溶剂相对强度数据。

优化流动相类型和组成，通常首先试用高含量有机溶剂（≧80%)，而含水量较低，或纯有机溶剂，以确保试样中所有组分在较短时间被洗出，便于对k值作出评估；然后逐步增加水含量或改换有机溶剂类型，调节k和提高a。色谱分离表明将甲醇改为四氢呋喃（THF)，组分保留和洗出顺序完全逆转。说明甲醇改为四氢呋喃或增加四氢呋喃，保留值不变而a改变。

反相色谱优化溶剂组成时，除CH3CN、MeOH和THF外，有时也使用二氧六环、丙醇、二甲亚砜、2一甲氧乙醇等。

3．流动相pH

流动相缓冲溶液pH对离子性溶质保留有显著影响，pH变化可导致k值10倍左右变化，视溶质离子化基团多少而异。流动相pH可改变解离溶质的电离程度。分子态溶质具较高疏水性，k值较高；电离成离子态，疏水性降低导致k值下降；电离基团越多，疏水性越弱，k值越小。描述反相色谱中流动相pH对不同类型溶质保留的影响，当pH升高，酸失去质子解离；而当pH降低时，碱获得质子解离。因此随pH升高，酸的保留值降低，而碱的保留值升高，中性溶质保留值基本不变。几乎所有与pH相关有机酸碱性溶质保留值变化均发生在pKa值±1.5单位的pH范围内。当分离酸或碱性化合物，加入缓冲剂控制流动相pH，抑制溶质电离，以获得较高k和a，这种色谱技术称为离子抑制色谱。若离子抑制色谱不能有效分离各组分，可考虑采用离子对色谱方法。

4．衍生化技术

与气相色谱类似，HPLC也采用衍生化技术，特别是反相色谱，通过试样组分柱前衍生化可达到两个目的：一是降低溶质极性，提高疏水性，更有利于条件温和、重现性好的反相色谱分离，而不必采用吸附或离子交换分离；二是向溶质中引进检测响应，主要是紫外吸收、荧光激发基团，以提高检测灵敏度或高选择性检测响应。溶质柱后衍生化则只有利于提高检测灵敏度。

四 键合相色谱应用实例

相对分子质量＜10000的脂溶性试样一般采用反相色谱分离。30种生理重要的氨基酸以邻苯二甲醛自动化柱前衍生RPC分离，如不柱前衍生则只能采用离子交换分离、柱后与苗三酮反应和光度法检测，操作较为复杂。极性氨基柱反相色谱条件下分离水溶性、强极性糖类化合物，这是氨基柱的典型应用实例。