样品中的非蛋白杂质能够影响蛋白质分离和随后的双向电泳结果显影。因此，在样品制备过程中，应除去这些杂质。

(1) 样品制备过程带来的盐盐能影响电泳，因此必须去除，或尽可能地使其保持较低浓度。IPG胶条中的盐能增加胶条的电导。如离子移到胶条的两端前，蛋白质聚焦将不能发生，这样就延长了等电聚焦所需时间，也会引起水分的移动，从而使胶条的一端肿胀而另一端变干。胶条中的盐能引起胶条两端很大一块区域内蛋白不发生聚焦（在最终的结果中表现为水平拖尾或空白）。若要将样品在IPG干胶条再水化时加样，再水化液中的盐浓度应当低10mmol/L。若样品在样品杯中加样，则样品中高达50mmo1/L的盐浓度是可以容忍的，然而，由于蛋白质迅速向低盐浓度的区域移动，在样品加样点处蛋白质有可能发生沉淀。

可通过下列方法除盐：透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀／重悬法。透析法是相当有效的除盐方法，样品的损失量小。然而，这个过程耗时较长且需要样品体积较大。旋转透析法速度较快，但存在透析膜吸附蛋白的问题。旋转透析法应该在加尿素和去污剂前进行。凝胶过滤可以采用，但往往引起大量的蛋白丢失。沉淀／重悬法是除去盐和其他污染物相当有效的方法，但它也会产生蛋白丢失。

(2）内源性带电小分子（核昔、代谢物、磷脂等）在任何样品溶解液中都存在着内源性带电小分子。这些物质往往带有负电荷，在正极端能引起蛋白聚焦不完全。TCA/丙酮沉淀法对除去这些物质相当有效，也可以利用其他去盐技术。

(3）离子型去污剂离子型去污剂（通常指SDS)常常在蛋白质提取和溶解过程中使用，但是对等电聚焦的影响特别大，电泳前应将SDS去除或分离。SDS能与蛋白质结合，并产生带负电荷的复合物，使蛋白质不能正常地聚焦。在含有两性电解质或非离子去污剂（CHAPS、Tritonx-100或NP-40）的再水化液中稀释含有SDS的样品，直至SDS终浓度为0.25％或更低，且使其他的去污剂和SDS的比例为8:1。丙酮沉淀能部分去除SDS，在室温下沉淀即能有效去除SDS，但蛋白在-20℃沉淀更彻底。

(4）核酸（DNA, RNA）核酸能增加样品的粘度，并且能产生背景污染。高分子量的核酸能堵塞凝胶孔隙。核酸能与蛋白质通过静电反应而相互结合，阻碍蛋白聚焦。若将分离的样品进行银染，核酸也能被染色，因此会在第二向胶中产生背景污染。富含核酸的样品可用不含蛋白酶的DNase/RNase混合物处理，使核酸降解成单核苷酸或寡核苷酸。在样品中加入0.1倍体积的含lmg/ml DNase I、 0.25mg/ml RNaseA和50mmol/L MgCl2溶液，冰上孵育。注意：DNase和RNase蛋白有可能在双向电泳图谱中出现。超离心技术能将大分子的核酸除去，然而这种方法也能使大分子量的蛋白质丢失。在低离子强度提取条件下，带负电荷的核酸有可能与带正电荷的蛋白质形成复合物。高离子强度或高pH的提取液能减少这种反应（注意在提取过程中加入的盐必需随后除去）。

(5）多糖多糖会阻塞凝胶孔，引起沉淀或延长聚焦时间，导致水平拖尾。一些带负电荷的多糖可与蛋白通过静电作用而相互结合。用TCA、硫酸铵或酚／乙酸铵沉淀，离心。超离心会除去高分子量多糖。采用与阻止蛋白一核酸相互作用相同的方法也很有用（将样品溶入SDS中或高pH溶液中）。

(6) 脂类（lipids）许多种蛋白质，尤其是膜蛋白能与脂类结合，这样既降低可溶性又能影响pH和分子量。脂类与去污染剂形成复合物，因而降低了去污剂的作用。将富脂组织离心后，常见到一层脂质层，很难被除去。强变性条件和去污剂能减少蛋白质一脂类反应。因此在样品制备过程中，需要过量的去污剂，并可利用丙酮沉淀法去除一些脂类。

(7) 酚类化合物（phenolic compounds)酚类化合物存在于植物组织中，能通过酶催化氧化反应来修饰蛋白质。在组织提取过程中，可以利用还原剂（DTT, 2-巯基乙醇、亚硫酸盐、抗坏血酸盐等）来防止酚类氧化物产生。利用沉淀技术，能迅速地将蛋白质与酚类化合物分开。二乙基二硫代氨基甲酸（diethyldithiocarbamic acid）或硫脲( thiourea )等抑制剂，可以抑制多酚氧化酶的作用。PVP或PVPP吸附剂的吸附，可将酚类化合物除去。

(8）不溶物质不溶物质能堵塞凝胶空隙，使聚焦质量下降。使用样品杯加样时，不溶物质尤其是个问题，它能阻碍蛋白质进入IPG胶条。在进行第一向等电聚焦（IEF)前，用离心法将样品纯化。