了取得良好聚焦的第一向分离，样品蛋白必须充分解聚并完全溶解。不管样品是否是较粗的裂解物或经过了样品沉淀过程，样品溶液中必须含有某些成分，以确保在进行第一向等电聚焦（IEF )前，样品完全溶解和变性。这往往包括尿素以及一种或多种去污剂。尿素和兼性离子去污剂CHAPS对许多种类的样品具有很好的溶解作用。还原剂和IPG缓冲溶液经常被加人到样品溶液中，以提高样品的溶解度。

在变性条件下进行等电聚焦（ IEF）能得到最好的分离和最清晰的结果。尿素是一种中性的促溶剂，在双向电泳的第一向中被用作变性剂。双向电泳第一向样品溶液中经常含有尿素，其浓度为8 mol/L。尿素能使许多种蛋白溶解并展开形成完全随机的结构，将所有的离子基团暴露在溶液中。除了尿素，硫脉最近也被发现能提高蛋白质的溶解度，尤其是膜蛋白。

为了确保样品的完全溶解和防止通过疏水相互作用而使蛋白质相互结合，样品溶液中往往包含非离子或兼性离子去污剂。原先使用NP-40和Triton X-100这两种性质相近的非离子去污剂。后来的研究证明，兼性去污剂CHAPS的效果更好。一些新的兼性离子去污剂据报道可提高膜蛋白的溶解性。

当样品完全溶解困难时，阴离子去污剂SDS能被用做促溶剂。SDS是一种相当有效的蛋白质促溶剂，但它由于能与蛋白质形成复合物并且带负电性，在双向电泳中，不能单独使用这种去污剂来溶解样品。普遍使用的去除SDS干扰的方法是，将样品在含有过量的CHAPS、TritonX-100或NP-40的溶液中稀释。最终SDS的浓度为0.25％或更低，过量的去污剂和SDS的比例至少为8:1。

为了破坏二硫键，并且使所有蛋白质处于还原状态，样品溶液中往往加入还原剂。经常使用的还原剂为DTT，使用浓度为20-100mmol/L之间。DTE与DTT性质相近，也能用作还原剂。原先，2-巯基乙醇被用作还原剂，但是因为需要高浓度的还原剂，所以还原剂内含的杂质可能引起污染。最近，非琉基还原剂TBP (tributyl phosphine）被用作双向电泳样品的还原剂，使用浓度为2mmol/L。但是TBP溶解性差并在溶液中不稳定，如果在样品制备时使用，需要巯基还原剂如DTT在再水化和第一向等电聚焦时维持蛋白处于还原状态。

载体两性电解质或2% (V/V) IPG缓冲液可包含在样品溶解液中。通过电荷与电荷之间的作用减少蛋白质结合来增加蛋白质的可溶性。有时候当需要碱性条件以完全溶解蛋白或抑制蛋白水解时，可加入缓冲液和碱（如40 mmol/L Tris碱）。但是引入离子成分会影响第一向结果，碱或缓冲液在第一向等电聚焦前要稀释到5 mmol/L。

样品在离心至上样之前，应当保留在样品溶液中在室温下维持至少30 min，使之充分变性和溶解。有去污剂存在的样品，加热能促进样品的溶解，但是只有在加入尿素之前才能加热，超声波能加快蛋白质溶解，尤其是来源于那些相当难溶材料的样品。

当你在首次对未知样品进实验时，建议使用以下的样品溶液：8mol/L尿素，4% CHAPS，60 mmol/L DTT，2% Pharmalyte 3-10，0.002%溴酚蓝。溶解大蛋白或疏水蛋白等更难溶的蛋白可以使用以下方法：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 60mmol/L DTT, 2%Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其他污染物。将组织在研钵中用液氮研碎，并将粉末悬浮在含有10% TCA, 0. 3% DTT的丙酮中。在-18℃条件下过夜并离心，用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9mol/L尿素、2% CHAPS、1％DTT和2% Pharmalyte 3-10中。