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DNA点突变的基本理论知识

发布时间:2015-09-18 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:731

DNA点突变在分子生物学中应用广泛,在信号转导研究中,常常应用于基因启动子或增强子的研究。检测某些基因在特定的应答元件发生点突变情况下,该基因对相应的细胞外信号的反应改变。因此,把感兴趣的基因转录的调控元件进行点突变后,克隆在荧光素酶的上游或其他适当的地方,构建成报告基因质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。

通过荧光素酶活性的高低判断突变前后或不同刺激对感兴趣调控元件的影响。

荧光素酶报告基因检测方法(luciferase reporter gene assay)是以荧光素(luciferin )为底物,萤火虫荧光素酶( firefly luciferase)可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后通过荧光测定仪(luminometer)或液闪测定仪,就可以测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来降低实验中其他变化因素的影响。但传统的共报告基因(比如CAT,β - Gal和GUS)不够便利,各自的测试化学、处理要求和检测特点存在差异。Promega公司的双荧光素酶报告基因(DLRTM)检测系统提供了有效的双报告基因检测手段。在DLR TM检测中,萤火虫荧光素酶和海肾(renilla reniformis )荧光素酶可在单个样品中连续测量。测量过程是:加入荧光素酶检测试剂II(LAR II)产生萤火虫荧光信号,信号持续至少1分钟,这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后,再在同一样品中加入Stop & GoR试剂,将上述反应淬灭,并同时启动海肾荧光素酶反应,进行第二次测量。如果使用带有试剂自动注射器的荧光发光计,两个检测可在4秒内完成。在DLR TM检测系统中,两个报告基因产生的线性检测范围均在小于10-18摩尔的灵敏度范围内,两个报告基因在实验宿主细胞内均无内源活性。另外,此系统中一体化形式的双荧光素酶检测,既可快速定量检测转染细胞,也可用于快速定量检测无细胞转录/翻译反应体系中的两个报告基因。

低氧诱导因子-1 (HIF-1)是细胞核内的一种转录因子,调节众多基因在低氧条件下转录的改变。受其调节的基因大多具有低氧应答元件,其保守序列为(5’-RCGTG-3')。然而真核细胞表达调控往往是多种转录因子的共同作用结果,因此可以应用点突变研究基因在低氧条件下,HIF-1、其他一些转录调节因子的作用,以及它们之间的相互影响。

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