样品加半乳糖转移酶标签前应充分变性，如在10mmol/L DTT和0. 5% (W/V) SDS中煮沸。SDS的最高浓度为0.5% (W/V)（注释16)。 SDS溶液应该用10倍的NP -40 (V/V）滴定，所以溶液中NP-40终浓度达到5% (V/V)。注意溶液需稀释至NP-40终浓度低于2%。半乳糖转移酶活性需1 -5mmol/L Mn 2+，如果Mn2+浓度过高（> 20mmol/L)或者有Mg2＋存在，其活性将被抑制。

为了控制特异性，样品应该用肽：N糖苷酶处理（对照实验3),以去除N连接糖基的影响。加入标签后，蛋白即可经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测。

(1）材料

1) 蛋白样品。

2) H缓冲液：50 mmol/L HEPES, pH 6.8; 50mmol/L NaCl; 2%（V/V) Triton X-1000

3) 10×标记缓冲液：100mmo1/L HEPES, pH 7.5; 100mmol/L半乳糖；50mmo1/L MnC12。

4) 5mmol/L 5’单磷酸腺苷(5’-AMP)，溶于超纯水，pH 7. 0。

5) 1. 0mCi/ml（比活性17.6 Ci/mmol）尿苷5’-二磷酸-［3H]半乳糖（UDP-［3H] Gal)，溶于70% (V/V）乙醇。

6）非放射性UDP-Gal。

7）终止液：10%（W/V) SDS；0. l mol/L EDTA。

8）脱盐柱，葡聚糖凝胶G50 (30× l cm) ; 50mmo1/L甲酸胺；0. 1 % (W/V) SDS溶液中平衡。

(2）方法

1) 高速真空泵除去标记液中溶剂，25mmol/L 5’-AMP重悬，每个反应加50μ1（见注释10)。

2) 建立反应体系

样品，终浓度0.5-5mg/ml50μl

H缓冲液 350μl

10×标记缓冲液50μ1

UDP-［3 H ] Gal/5’-AMP50μ1

半乳糖转移酶30-50U/ml 2-5μl

小牛小肠碱性磷酸酶（注释11)1-4U

超纯水定容至 500μl

3) 37℃反应2h或4℃过夜。

4）加预冷的UDP-Gal至终浓度0.5-1. 0mmol/L，再加2-5μl 半乳糖转移酶。

5）加50μl反应终止液，并加热至100℃，5 min。

6）葡聚糖凝胶G50柱（30×lcm, 50mmol/L甲酸胺，0. 1 % (W/V) SDS平衡）去除标记蛋白，每管收集lml。

7）每管取50μl用液体闪烁计数器计数。

8）每2 μg卵清蛋白应掺入2×106DPM（每分钟衰减量）的3H-半乳糖。

9）将所有收集液收集在一起，冻干。

10) 100-1000μl超纯水重悬，丙酮沉淀。

11）加3-5倍预冷丙酮（-20℃）。

12）-20℃冻存2-18h。

13）3000-16000g, 4℃离心l0min，收集沉淀。