1．方法原理

本方法用环己烷萃取水中多环芳烃（PAH ),萃取液通过佛罗里硅土柱，PAH被吸附在柱上，用丙酮与二氯甲烷的混合溶剂洗脱PAH，之后用具荧光或紫外检测器的高效液相色谱仪测定。本方法对六种PAH通常可检测到ng/L水平。

2.方法的适用范围

本方法适用于饮用水、地下水、湖库水、河水及焦化厂和油毡厂的工业污水中荧蒽、苯并［[b］荧蒽、苯并［[k]荧蒽、苯并［[a]芘、苯并［ghi]苝、茚并［[1, 2, 3-cd]花等六种多环芳烃的测定。

3．干扰及消除

水样中若存在可被共萃取并能产生荧光信号或熄灭荧光的物质对本法也有干扰。本法用佛罗里硅土柱层析净化分离，可降低荧光背景。

4．仪器

1)高效液相色谱仪：具荧光和紫外检测器的高效液相色谱仪。

①恒流梯度泵系统。

②反相柱：填料为Zorbax 5μODS，柱长250mm，内径4.6mm。

③荧光检测器：荧光分光光度计检测器，激发波长280nm，发射光波长（即测量波长）大于389nm截止点；荧光光度计检测器应有激发用的色散光系统和可用滤光片或色散光学系统的荧光发射部分。

④紫外一可见光检测器：可调波长紫外检测器或固定波长254nm的紫外检测器，可单独使用，也可以与荧光检测器联用。

⑤记录仪：与检测器匹配。

⑥微量注射器：5、10、50、100、500μl。

⑦恒温水浴（或恒温柱箱）。

2）采样瓶：1L具磨口玻璃塞的棕色玻璃细口瓶。

3) 振荡器：调速，配备自动间歇延时控制仪。

4）玻璃器皿：

①分液漏斗：l000nml，玻璃活塞不要涂润滑油。

②碘量瓶：200m1。

③层析柱：净化环己烷层析柱：长500mm，内径25mm，玻璃活塞不涂润滑油的玻璃柱。

样品预处理层析柱：长250mm，内径l0mm，玻璃活塞不涂润滑油的玻璃柱。

④K-D浓缩瓶：25m1，具刻度，容积必须进行标定，具磨口玻璃塞。

⑤ K-D蒸发瓶：500m1。

⑥K-D Snyder柱：三球，常量。

⑦K-D Snyder柱：二球，微量。

⑧量筒：500m1。

5）玻璃棉或玻璃纤维滤纸：在400℃加热1h。冷却后，保存在具磨口塞的玻璃瓶中。

6）沸石：在100℃加热lh。冷却后，保存在具磨口塞的玻璃瓶中。

5．试剂

1) 高效液相色谱流动相为水和甲醇的混合溶液。

①甲醇：HPLC分析纯。

②纯水：电渗析水或蒸馏水，加高锰酸钾在碱性条件下重蒸。在测定的化合物检测波长处未观察到干扰。

2)二氯甲烷：优级纯，用全玻璃蒸馏器重蒸馏，在测定化合物检测波长处不出现色谱干扰为合格。

3）丙酮：同上。

4）环己烷：同上。

5)无水硫酸钠：分析纯，在400℃加热2h.

6）硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O)：分析纯。

7)佛罗里硅土（Florisil) : 60-100目，色层分析用。在400℃加热2h。冷却后，用纯水调至含水量为11%。

8) 碱性氧化铝：层析用，50-200μm，活度为Brockmann I级。达到I级的制备方法如下：

将氧化铝加热至550℃±20℃至少2h，冷却至200-250℃，移入放有高氯酸镁的干燥器内，继续冷却，即得活度为Brockmann I级的氧化铝。在干燥器内可存放5d。

9)硅胶：柱层析用，100目，在300℃干燥4h。

10）浓硫酸：优级纯。

11)色谱标准物：固体多环芳烃标准物为荧葱、苯并［k]荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并［[a]芘、茚并［[1, 2, 3-cd]芘及苯并［ghi］苝等六种，纯度在％％以上。采用固体标准物配制标准贮备液，亦可采用经证实为合格的市售多环芳烃标准溶液配置标准贮备液。

12）用固体多环芳烃配制标准贮备液：分别称量各种多环芳烃20mg±0.lmg，分别溶解于50-70ml环己烷中，再以环己烷稀释至100m1，配成浓度为200μg/ml单个化合物的标准贮备液。若用市售溶液配制标准贮备液，可在容量瓶中用环己烷稀释，使标准贮备液的浓度各为200μg/ml的单化合物溶液。贮备液保存在4℃冰箱中。

13)混合多环芳烃标准溶液的配制：在l 0ml容量瓶中加入各种PAH贮备液lml±0.0lml，用甲醇稀释至标线，使标准溶液中各种多环芳烃的浓度为20μg/ml。标准液保存于4℃冰箱中。

14）标准工作溶液：根据仪器灵敏度及线性范围的要求，取不同量的混合多环芳烃标准溶液，用甲醇稀释，配制成几种不同浓度的标准工作溶液。

注意：有些多环芳烃是强致癌物，因此操作时必须极其小心。不允许人体与多环芳烃固体物质、溶剂萃取物、多环芳烃标准品接触。多环芳烃可随溶剂一起挥发而沾附于具塞瓶子的外部，因此处理含多环芳烃的容器及实验操作过程必须使用抗溶剂的手套。被多环芳烃污染的容器可用紫外灯在360nm紫外线下检查，并置于重铬酸钾一浓硫酸洗液中浸泡4h。标准溶液应在有适当设备（如合适的毒气橱、防护衣服、防尘面罩等）的实验室中配制。用固体化合物配多环芳烃标准品，在没有合适的安全设备及尚未正确掌握使用技术之前，不能进行。

6．步骤

(1)水样的采集与保存

样品必须采集在玻璃容器中，采样前不能用水样预洗瓶子，以防止样品的沾染或吸附。防止采集表层水，保证所采样品具有代表性。在采样点采样及盖好瓶塞时，样品瓶要完全注满，不留空气。若水中有残余氯存在，要在每升水中加入80mg硫代硫酸钠除氯。水样应放在暗处，在4℃冰箱中保存；采样后应尽快在24h内进行萃取。萃取后的样品在40d内分析完毕。

(2）水样萃取

摇匀水样，用500m1量筒量取500m]水样（萃取所用水样体积视具体情况而定，可增减），加入50ml环己烷，手摇分液漏斗，放气几次后，安装分液漏斗于振荡器架上，振摇5min进行萃取。取下分液漏斗，静置约15-30min（静置时间视两相分开情况而定），分出下层水相留待进行第二次萃取，上层环己烷相放入200m1碘量瓶中，再用50m1环己烷对水样进行第二次萃取，水相弃去，环己烷萃取液并入同一碘量瓶中，加无水硫酸钠至环己烷萃取液清澈，至少放置30min，脱水干燥。

(3)萃取液的净化

饮用水的环己烷萃取液可以不经柱层析净化，浓缩后直接进行HPLC分析。地表水及工业污水环己烷萃取液的净化：

①层析柱的装填：在玻璃层析柱的下端，放入少量玻璃棉或玻璃纤维滤纸以支托填料，加入3m1环己烷润湿柱子。称4-6g佛罗里硅土于小烧杯中，用环己烷制成均浆，以湿式装柱法填入上述柱中。净化地表水的柱内填充4g佛罗里硅土；净化污水的柱，填充6g佛罗里硅土。放出柱中过量的环己烷至填料的界面。

②萃取液的净化：从层析柱的上端加入已脱水的环己烷萃取液，全部溶液以1-2ml/min流速通过层析柱，用环己烷洗涤碘量瓶中的无水硫酸钠三次，每次（(5-10)而，环己烷洗涤液亦加入到层析柱上，回收通过柱的环己烷。被吸附在柱上的PAH用丙酮和二氯甲烷的混合溶液洗脱。地表水用100m1 (88m1丙酮+12m1二氯甲烷）洗脱；污水用75m1 (15m1丙酮+60ml二氯甲烷）洗脱。洗脱液收集于己联接K-D蒸发瓶的K-D浓缩瓶中，加入两粒沸石，安装好三球Snyder柱待浓缩。

(4）样品的浓缩

将K-D浓缩装置的下端浸入通风橱中的水浴锅中，在65-70℃的水温下浓缩至约0.5m1，从水浴锅上移下K-D浓缩装置，冷却至室温，取下三球Snyder柱，用少量丙酮洗柱及其玻璃接口，洗涤液流入浓缩瓶中。加入一粒新沸石，装上二球Snyder柱，在水浴锅中如上述浓缩至0.3.0.5ml，留待HPLC分析。

注：甲醇、环己烷、二氯甲烷及丙酮等易燃有机溶剂，应在通用橱中操作。

(5) HPLC分析条件

①柱温：35℃。

②流动相组成：A泵：85％水＋+15％甲醇；B泵：100％甲醇。

③洗脱：视色谱柱的性能可采用恒溶剂洗脱，即以92% B泵和8% A泵流动相组成，等浓度洗脱。梯度洗脱，即以60% B泵+40% A泵的组成洗脱，保持20min；以3% B/min增量至成为％% B+4% A泵的组成，保持至出峰完；以8% B/min减量至成为60%B泵＋40%A泵的组成，保持15min，使流动相组成恒定，为下一次进样准备好条件。

④流动相流量：30ml/h恒流或按柱性能选定流量。

⑤检测器波长的选择：六种多环芳烃在荧光分光光度计特定条件下最佳的激发和发射波长。水样中含茚并［[1, 2, 3-cd]芘时选λex= 340nm, λem=450nm较好，在此波长下茚并［[1, 2, 3-cd]芘的荧光强度较高；否则选λex= 286nm, λem=430nm对苯并［[a]芘灵敏度较高。

⑥荧光计检测器：单色光荧光计使用λex 300nm, λem=460nm为适宜；滤光器荧光计在λex 300nm, λem>370nm下测定。

⑦紫外检测器：在254nm下检测PAH。

⑧进样方式：以注射器人工进样（或采用自动进样器进样）；进样量：5-25μl。

⑨定性分析：化合物在不同填料的色谱柱上出峰顺序有所不同，下图为两种不同检测器串联的16种PAHs标准色谱图。图4-4-23为紫外检测器在波长254nm下的色谱图；图4-4-24为荧光检测器在λex＝ 286mn, λem=430nm下的色谱图。多环芳烃标样各化合物浓度为2μg/ml，进样量10μl。各组分的出峰次序为：1.萘，2.二氢苊，3.苊＋芴，4.菲，5.蒽，6.荧蒽，7.芘，8.苯并［[a]蒽＋枹，9.苯并[b]荧蒽，10．苯并［[k］荧蒽，11．苯并［a]芘，12．二苯并［[a, h]蒽，13．苯并［[ghi]芘，14.茚并［[1, 2, 3-cd]芘。以试样的保留时间和标样的保留时间相比较来定性。用作定性的保留时间窗口宽度以当天测定标样的实际保留时间变化为基准。用一个化合物保留时间标准偏差的三倍计算设定的窗口宽度。

⑩定量分析：用外标法定量，在线性范围内用混合PAR标准溶液配制几种不同浓度的标准溶液，其中最低浓度应稍高于最低检测限。

11.HPLC中使用标准样品的条件：标准样品与样品进样体积最好相同，两者的响应值也要相近；在工作范围内，相对标准偏差＜10%；标准样品与试样应尽可能同时进行分析。

12.每个工作日必须测定一种或几种浓度的标准溶液来检验校准曲线或响应因子。如果某一化合物的响应值与标准值间的偏差大于10%，则必须用新的标准对该化合物绘制新的校准曲线或求出新的响应因子。

7．计算

用外标法计算试样中的浓度。

Xi=Ai·Bi·Vt/Vi·Vs

式中：Xi一一试样中组分i的含量(μg/L) ;

Ai—一标样中组分i进样量对其峰高（或峰面积）的比值（ng);

Bi—一样品中组分i的峰高（或峰面积）；

Vt——萃取液浓缩后的总体积（μl);

Vi一一注射样品的体积（μl);

Vs——水样体积（μl）。

8．精密度和准确度

①精密度。

②准确度。

③检出限：以HPLC最灵敏档噪声的五倍作为仪器的检出限。