一、培养用液及无菌试剂的选择

哺乳动物细胞体外培养是否正常，关键的影响因素有培养用液配制用水纯度、无菌操作严格程度、培养液选择、试剂选择等方面，其中任意一种因素都可能是致命性的影响，导致不可挽回的后果。下面将简要介绍培养用液及其他无菌试剂的选择原则和注意事项。

（一）液体培养基和干粉基础培养基

1．品牌选择

适用于哺乳动物细胞培养的液体培养基和干粉基础培养基均需从商品供用户选择，著名的品牌如Gibco、Sigma、ATCC等。

从Gibco的官方网页可查询到，他们专门为哺乳动物细胞培养、原代细胞培养、干细胞培养、昆虫细胞培养等方面提供了各种套餐式培养基产品服务，关于哺乳动物细胞培养用液的种类非常齐全。另外，为转染也提供配套使用的试剂。

转染，也称细胞转化，都是指将外源基因转入感受态靶细胞的方法，转染方法包括共转染、瞬时转染、体内转染、稳定转染、电穿孔法转染、磷酸钙转染和脂质体转染等。

2．培养基型号

除了选择品牌供应商外，还需特别注意所培养细胞适合的是何种培养液或干粉培养基。如常用的DMEM、RPMI1640、199、MEM等型号。

3．包装规格

另外，就是选择好培养液或干粉培养基的包装规格，如Gibco的RPMI1640培养基的规格由4种搭配状态：①谷氨酞胺添加状态分为已添加GlutaMAX、已添加L-谷氨酞胺、未添加谷氨酞胺3种情形；②酚红添加状态分为是否添加2种情形；③培养基的物理形态包括固体和液体2种；④提供包括100m1/瓶、500ml/瓶、1L／瓶、5L／瓶和10L／瓶5种包装规格备选。

（二）哺乳动物细胞培养试剂

哺乳动物细胞培养所需的其他试剂也要从品牌、试剂级别、包装规格等要素进行采购，否则，影响培养细胞的正常生长和活性。

1．缓冲液配制用化学试荆或成品缓冲液药片

一般要求AR（分析纯）级以上纯度的试剂，无机试剂从国内品牌供应商即可采购到，个别无机试剂和重要有机试剂如DMSO（二甲基亚砜）、BR（生物试剂）建议购买国际品牌供应商的产品，如Sigma品牌的产品。这些试剂都是非无菌包装的，实际使用时需要注意。但是，一般在冻存细胞时，直接取DMSO配制新鲜冻存液而不会污染微生物，因为DMSO本身是不含活的微生物的，DMSO也称万能溶剂，微生物是不能存活的。利用购买的试剂，按照缓冲液配方配制和滤过除菌或高压蒸汽灭菌都是非常容易控制和操作的。

成品缓冲液药片是日常配制常用缓冲液如PBSA,Hank's溶液的便利选择，容易保存。由于使用量偏大，容易配制，不建议直接购买无菌液体包装的缓冲液。值得注意的是，成品缓冲液药片不一定是无菌的，使用时需要注意药品包装说明。

2．细胞培养添加物

细胞培养添加物包括胎牛血清、生长因子、培养液补充物、培养用抗生素等，这些添加物都是无菌包装的，存放和使用时注意严格无菌操作。有时也使用筛选后适合的小牛血清或新生牛血清替代胎牛血清，目前国内有多个品牌供应商提供胎牛血清。培养用抗生素可直接使用临床使用的产品，如可以采用8×104U/2ml/支包装的硫酸庆大霉素稀释后直接添加到培养液中。

细胞培养用的生长因子，以及培养液补充物如L-谷氨酞胺、葡萄糖等，建议从信誉好的制造商产品目录中选择，如Sigma产品。

二、培养用液的配制

细胞培养用液的配制用水最理想的是去除热原、无核酸酶的超纯水，也可使用新鲜制备的三蒸水、亚沸水或高纯水机制备的高纯水。一般而言，当配液用水的电阻率小于5MΩ·cm时，细胞活性容易受到干扰，如出现细胞形态变异、生长分裂受阻、坏死或凋亡等状况。

细胞培养用液配制过程使用的容器、搅拌子等器械，也务必使用配液用水润洗2-3次方可使用。

配制溶液过程中，由于开放的烧杯口、容量瓶口、三角烧瓶口均可受到环境粉尘的影响，因此，建议使用新鲜的保鲜膜遮盖开口部分，尤其是为了充分溶解而进行长时间搅拌的过程中。建议配液全程注意，防止粉尘污染所配制的溶液。

（一）干粉培养基选择及其液体培养基的配制

仔细阅读干粉培养基的包装说明，如lOX1L的包装是指内含10小包，每小包配制1000m1培养液。

配制时，适当添加血清以外的其他必需添加物，如抗生素、谷氨酰胺等，一并滤过分装，保存于2-8℃冰箱。

严格使用配制培养液的用水，建议使用超纯水或其他新鲜制备的高纯度的纯水，如亚沸水、三蒸水、高纯水机产的高纯水等。

使用于分装的玻璃试剂瓶需要提前按要求进行清洗灭菌。灭菌包装完整，保存在洁净间内。

（二）常用缓冲液的配制

平衡盐溶液即balancedsaltsolution，简称BSS。

1.PBSA溶液

KCl0.20g,KH2PO40.20g,MgSO4·7H2O0.98g,NaCl8.00g,Na2HPO4·7H2O2.16g,CaCl20.20g，加H2O至1000m1，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。

2.D-PBSA溶液KCl0.20g,KH2PO40.20g,NaCl8.00g,Na2HPO4·7H2O2.20g，加H2O至1000m1，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。

3.Hank's溶液

Na2HPO4·H2O0.06g,KH2PO40.06g,MgSO4·7H2O0.20g,葡萄糖1.00g,NaCl8.00g,KCl0.40g,NaHCO30.35g，酚红0.02g（其中，溶解NaHCO3后，将称量好的酚红一起溶解，均匀后再转移到容量瓶），CaC120.14g，加H2O至1000m1，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。

4.D-Hank's溶液

Na2HPO4·H2O0.06g，KH2PO40.06g,NaCl8.00g,KCl0.40g,NaHCO30.35g，酚红0.02g（其中，溶解NaHCO3后，将称量好的酚红一起溶解，均匀后再转移到容量瓶），加H2O至l000ml，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。

（三）消化液（胰蛋白酶消化液）的配制

精确称取0.25g胰酶蛋白酶（活力为1，250)，加入l00ml不含Ca2+、Mg2＋的D-Hank's或D-PBDA缓冲液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存。
胰蛋白酶溶液中也可加入终浓度为0.02%EDTA。

（四）冻存液的配制

9份10%BS培养液，1份DMSO。无菌条件下配制。DMSO无需滤过除菌，DMSO属于万能溶剂，不存在微生物污染，是无菌的。但在放入超净工作台内前，需用酒精纱布擦拭外表面的粉尘。

（五）其他溶液的配制

1.5mg/mlMTT溶液

准确称取MTT0.5g,溶于l00ml的0.0lmol/LpH值7.4的PBS溶液中，孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃下保存，两周内使用或-20℃冻存。

2.Giemsa染色液

(1)Giemsa原液的配制称Giemsa粉末0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33m1),56℃中保温90-120min后再加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。

(2)Giemsa应用液的配制使用时用PBS稀释，常用的稀释比例为1:10。

3.BrdU溶液

BrdU10mg,NaCl85mg，加水至loml,滤过除菌，4C下避光保存。宜现用现配或-20℃保存。

4.2×SSC溶液

NaCl1.75g，柠檬酸三钠·2H2O0.8858，加水至100ml,4℃保存。

5.100×谷氨酰胺溶液（200mmol/L)

L-谷氨酰胺29.2g，加Hank's缓冲液至1000m1。充分溶解后滤过除菌分装，-20℃保存。

6.100×杭生素溶液

100倍应用浓度的抗生素溶液，用Hank's缓冲液配制，充分溶解后滤过除菌分装，-20℃保存。