［实验器材]

1．仪器

倒置显微镜，CO2培养箱，普通冰箱，单人双面垂直风淋超净工作台，低速冷冻离心机，显微数码摄影系统，孵蛋器、50-200μl微量移液器。

2．材料与试剂

(1）非无菌材料孵化10d的鸡胚蛋，酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，记号笔，擦镜纸，洗耳球，酒精棉球，消毒酒精喷壶，酒精灯，废液缸。

(2)无菌材料和试剂：辅料镊,24孔细胞培养板，15ml离心管，长丝滴管，l0ml刻度液管，灭菌塑料吸嘴，0.25%胰蛋白酶溶液，含500U/ml硫酸庆大霉素的Hank's液，10%BS-DMEM培养液（100m1／瓶）,10%BS-RPMI1640培养液（l00ml／瓶），lmol/LHCl溶液。

(3）细胞材料悬浮型细胞如S180、SP2/0，贴壁型细胞如A375、SW480。

[操作步骤]

1．准备

(1)超净工作台除尘和消毒。依照顺序，首先用酒精棉球擦拭台面、仪器玻璃窗内表面和仪器玻璃窗外扶手位置；然后关闭双面玻璃窗，接通电源开关，开启风淋，开启紫外灯照射；30-40min后关闭紫外灯。

(2)在培养板的盖板短的方边上方靠边位置，用记号笔书写标识。建议每位操作者使用1块无菌24孔细胞培养板。标识内容和格式规定包括3部分：细胞名称用英文和数字；接种日期使用月日格式的4位数字，操作者学号数字的后3位。

(3)接种培养。接种一定密度的细胞悬液至起始培养孔。静置3-5min镜检细胞状况，如密度、活性。送37℃CO2培养箱培养。

(4)逐天镜检观察，记录生长状况和染菌状况。培养液呈黄色时说明酸度较高，细胞数量接近106/ml或接近单层细胞生长状态。尤其值得注意的是，污染有细菌的染菌孔，由于细菌生长分裂快，培养液中废弃物的累积，颜色也呈黄色，需谨慎甄别。

2．贴壁细胞的传代操作

(1)镜检观察24孔细胞培养板上培养孔内细胞的汇合程度，当细胞汇合或接近单层生长时进行如下传代操作。正常接种密度时，一般3-4d传代1次。

(2)超净工作台用消毒酒精除尘，紫外消毒30-40min。

(3)遵照无菌操作要求，用长丝滴管吸去孔内培养液，加入200-400μl0.25％胰酶溶液，使所有细胞都能被浸没，室温或37℃CO2培养箱消化3-10min。

(4）利用倒置显微镜和肉眼观察细胞的消化状况。当大多数贴壁的细胞收缩变圆并开始脱落时，即达到充分消化的程度。

(5)及时添加10m1Hank's液终止消化。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，转移至15ml离心管中，1000r/min离心6min，弃上清液。弹指法分散沉淀。

(6）用1.3-1.5ml10%BS-DMEM培养液重悬细胞，取其中5-10滴接种到新培养孔中，补充1.3-1.5m110%BS-DMEM培养液。每1滴液体的体积约60μ1。静置3-5min后镜检观察细胞状态，确认接种密度合适。送入37℃CO2培养箱培养。

(7)逐天镜检观察，记录生长状况和染菌状况。

2.悬浮生长细胞的传代操作

悬浮生长细胞的传代培养要比贴壁细胞简单得多，通常有两种方法。

(1)倒置显微镜下镜检24孔培养板内培养孔的细胞生长状况。符合传代要求时，进行如下传代操作。正常接种密度时，一般3-4d传代1次。

(2)需要传代时，使用已消毒的超净工作台。准备时需用消毒酒精除去超净工作台内部
台面的粉尘，紫外消毒30-40min。

(3)用长丝滴管吹打混匀孔内细胞，使成单细胞悬浮液。

(4）取2-4滴细胞悬浮液接种到新培养孔中，补充1.3-1.5ml10%BS-RPMI1640培养液。每1滴液体的体积约60μl。静置3-5min后镜检观察细胞状态，确认接种密度合适。送入37℃CO2培养箱培养。

(5)逐天镜检观察，记录生长状况和染菌状况。

(6)24孔板的传代顺序约定为A1→B1→C1→Dl→D2→C2→B2→A2→A3......S形顺序。一般每周传代1-2次，设法避开周六、周日这两天。连续培养30d的传代次数控制在10次以内。

［注意事项]

1．传代的比例取决于细胞的生长状态、生长速度以及实验的目的要求等因素，通常按
照1：2至1：10的比例进行传代。

2．贴壁细胞传代操作时，务必避免消化过度，以免细胞活性受到损害。

3．为了确保无菌操作的洁净环境，从除尘灭菌开始，超净工作的风淋送风始终保持开启，直至完成所有无菌操作过程。使用时开启照明灯。根据需要调节风淋速度为快速挡或慢速挡。

4．无菌操作时，酒精灯的使用不是必需的，可根据需要决定是否使用。

5．从普通冰箱取出的培养液，先用酒精棉球擦拭表面水汽和粉尘，再放置于超净工作台内，使温度平衡到室温。一般经过30min以上即可，使用前，如手感比较冰冷时，可用双手握拿培养液瓶体进行升温。

6．每次镜检时，记录传代培养孔的编号、细胞单层生长比例、培养液颜色、“大细胞”与“小细胞”的数量、死细胞与细胞碎片的数量、染菌状况。控制镜检时间，培养细胞离开正常培养环境的时间应控制在30min内，以免影响细胞的活性。

7．双手协助，将滴管尖口伸人废液缸内，退出胶头。将滴管平伏放置于废液缸侧边的台面上。