[实验器材］

1．仪器

倒置显微镜，数码摄影系统，超净工作台，CO2培养箱，食品级CO2钢瓶气，普通冰箱，空调，风淋门，洁净间，50-200μ1微量移液器。

2．试剂与材料

30%BS培养液（100m1/瓶。BS指小牛血清，FCS指胎牛血清），对数生长期的肿瘤细胞（悬浮生长型），无菌15ml外旋盖离心管，无菌96孔细胞培养板，灭菌塑料吸嘴，lmol/LHCl溶液，擦镜纸，洗耳球，酒精棉球，酒精灯等。

[操作步骤]

1．操作者双手清洗与消毒

进行无菌操作前，操作者的双手需在水槽用洗手液清洗除去可疑脱落物和粉尘。双手经热风干燥或自然风干后，用酒精棉球或外科消毒剂等各种合适的消毒剂擦拭。

2．超净工作台的除尘与消毒灭菌准备

无菌操作前的准备工作，依照顺序，首先用新洁尔灭、消毒酒精（75%，也称医用酒精）浸泡的干净纱布擦拭台面、仪器玻璃窗内表面和仪器玻璃窗外扶手位置。然后关闭双面玻璃窗，接通电源开关，开启风淋，开启紫外灯照射，30-40min后关闭紫外灯。

超净工作的风淋送风从除尘灭菌开始，始终保持开启，直至完成所有无菌操作过程才关闭仪器电源。

3．克隆化细胞培养的其他准备事项

检查克隆化用培养液的用量是否为llml，确认是否已预先分装于15m1外旋盖离心管内。

检查、记录待克隆化细胞的初始悬液中的细胞密度。密度不清楚时，需预先计数。

做克隆化使用无菌96孔细胞培养板的48孔，如Al-H6或A7-Hl2。用记号笔书写标识于盖子上面短边的边缘空白处。

标识内容和格式规定包括3部分，即细胞株名称编号（英文和数字）；培养的日期（月日格式的4位数字）；操作者学号数字（学号的后3位数字）。

检查单人双面超净工作台个人操作位内无菌器材的品种、数量是否齐全。其中，双份配置的物品包括微量移液器、胶头、辅料镊、预先分装于15ml外旋盖离心管的含血清培养液。

4．克隆化细胞培养用单细胞悬液制备

单细胞悬液是强调细胞悬液中，无组织样细胞团存在，几乎都是游离的单个细胞。当然，尚未分裂完全的2个细胞是黏连在一起的。

分别取200μl培养液到无菌96孔细胞培养的4个指定孔，即Al-D1或A12-D12。

混匀已知细胞密度的原细胞悬液，用微量移液器套取无菌吸嘴，移取50μl细胞悬液到指定孔，即Al或A12孔，轻柔地往复吹打混匀该孔，此时，此孔的细胞密度是原细胞悬液的1/5。为了避免形成过多气泡损害细胞，该操作过程应注意勿使空气进入孔内的细胞悬液。

为此，在操作微量移液器进行吹打时，推杆在“空载”档和“吸液”档之间移动，保留吸嘴内有液体残留。

按1：5连续稀释，顺次连续稀释到第4孔，即按照Al→B1→Cl→D1或者A12→B12→Cl2→D12顺序进行系列稀释。然后，根据原细胞悬液的细胞密度推算各孔的细胞密度。

根据实际需要，计算在50-150μl范围内，哪个稀释孔可以取得150个细胞。明确应取多少μl细胞悬液。

记录离心管内剩余的培养液体积数。换新吸嘴，定量移取该稀释孔细胞悬液（含150个细胞）到该离心管内，充分洗落吸嘴内的细胞到离心管内。旋紧离心管外盖，轻缓地反复倾倒该离心管即可混匀，即准备好铺板用的细胞悬液。

5．铺放细胞悬液至96孔培养板

用食指和中指夹取去盖离心管的上部，小心地用相同手掌的拇指和食指夹拿铺放细胞悬液一侧的盖板，悬空置于孔板的斜上方。

用微量移液器每次吸取200μl于指定孔内。依次操作，快速铺放至96孔培养板内指定
的44个培养孔内。盖好板盖。

具体可参照图10-6中的步骤，图示有两种方案，请注意区分。

6．培养前的镜检

从超净工作台内取出培养板，置于倒置显微镜载物台上，用10×接物镜，即100×放大，观察克隆培养孔和稀释孔内细胞的状况。由于克隆培养孔落入细胞的概率是3个／孔，很难观察到细胞，但对于此时培养孔内的显微影像观察非常必要，是随后逐天观察的基础和参比。

7．送入CO2培养箱进行培养

培养条件是37℃、5%CO2浓度、饱和湿度（相对湿度90％以上），箱体内定期除尘消毒灭菌。

8．细胞克隆观察

细胞克隆是由单一细胞经分裂形成的细胞集落。正常情况下，第10天左右，单一克隆可以充满100×视场。

对于克隆培养孔内的细胞克隆大小和组成细胞数，可参照稀释孔内的克隆生长情形。也可以依据理论计算，克隆的细胞数＝2n-1，其中，n为培养的夭数，可以推论，第1、2、3天的细胞数分别为1、2、4，其余可类推。如果接种时细胞未完全分裂，其细胞数=2×2n-1。

从CO2培养箱小心取出培养板，镜检观察孔内细胞状况，在有克隆生长培养孔上方的盖子上用记号笔书写克隆数。

记录培养孔克隆生长状况到“克隆观察记录表”（表10-1)。第3-5天进行第1、2次观察，每次观察其中的24孔，填写“克隆观察记录表”。第7-11天完成第3、4次观察，每次观察其中的24孔，注明“克隆观察记录表”中存在数据变化的培养孔。

比较两次“克隆观察记录表”数据，统计单克隆孔数，求算单个细胞克隆生长孔的百分数，即＝（单个细胞克隆生长孔孔数／44)×100%。

[注意事项］

1．第5天观察后，需要对所有克隆生长的培养孔进行半量换液。

2．第2次克隆观察，发现培养孔内克隆数增多时，需要做适当的判断。判断是否由于换液操作导致原有克隆的部分细胞游离，形成新的克隆。

3．单手拿取培养板，另一手顺次开启CO2培养箱的外门和玻璃门，小心将培养板放置于指定搁板方位，关闭箱门进行培养。

4．特别需要注意的是，培养状态的细胞在离开正常培养环境，在室温下的时间超过30min，对细胞活性就有明显影响，超过60min则有显著影响甚至毁灭性影响。