一、细胞冻存

（一）冻存的理由和必要性

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株系，要将细胞冻存。主要理由有以下几个方面：

(1)培养状态下，细胞株系的遗传稳定性可能发生不可逆的变化。

(2)细胞系或细胞株都有寿命，分裂次数有限，连续培养容易衰老死亡。

(3)培养状态下，微生物污染概率增加。

(4)培养状态下，其他培养物细胞的污染概率增加。

(5)冻存暂不使用的细胞株系，可节省时间和材料试剂，降低运行成本。

(6)长途运输细胞株系需要。

(7)培养箱故障时，可能导致所培养细胞株系的毁灭。

（二）冻存前确认

(1)确认细胞株系未受微生物污染。

(2)确认细胞株系未受其他培养物细胞的污染。

(3)少量冻存复苏，重复上述的确认。

（三）冻存原理

为使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的冰晶形成，减少细胞内水凝固时所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损失。为此，常用以下方法：

(1)缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不可太慢，以免冰晶形成。

(2)用亲水的低温保护剂排除细胞内水分。

(3)在尽可能低的温度下保存细胞，降低高浓度盐对冰中的蛋白成分产生变性影响。

(4）快速复苏，减少细胞内冰晶形成，降低细胞内残留冰溶解时产生可溶性成分的机会。

（四）冻存形式和方法

冻存时，一般用温度为-196℃的罐装液氮或使用-80℃超低温冰箱，罐装液氮内非液体部分的温度是-130一-110℃。将细胞收集至冻存管中，加入含保护剂（一般为DMSO或甘油）的培养液，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

冻存时，冻存温度、保护剂的选用、细胞密度、降温速度等都对细胞活力有影响。-196℃冻存时间最长，而-80℃冻存时间有人认为不宜超过10年。-80℃冻存的细胞每年的死亡率为5%-10%DMSO的使用浓度为5%-15%，常用7.5%-10%。甘油做保护剂时，使用浓度为10%-15%，冻存时间不宜超过1年。冻存时，理想的细胞密度为106-107/ml。

二、细胞复苏

复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放人35-45℃水中，使之在lmin内迅速融解，缓慢稀释细胞悬液，离心处理后使用新鲜培养液重新悬浮细胞，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

复苏时温度、融化速度等对细胞活力会产生至关重要的影响。要求融化时间越短越好。

最常使用的水浴冻融温度是36-38℃，一般使用37℃水浴，最大限度地保护复苏过程温度对细胞活性的影响。

水浴用水最好使用无菌水，如新鲜的超纯水或高纯水，在升温准备水浴的过程中使用保鲜膜覆盖防尘。避免直接使用自来水准备水浴，因为自来水中有大量微生物，会增加微生物污染的风险。

DMSO在常温下对细胞有明显毒性，所以，在复苏过程中，应及时充分地去除DMSO。

一般使用8-10倍稀释，离心去除上清。稀释可使用Hank's缓冲液。

DMSO能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套。因此，任何常用的具有潜在危险的物质，如致癌剂，均可能穿透皮肤，甚至能透过橡胶手套而进入血液循环。DMSO也称万能溶剂。在使用DMSO的过程中，存在任何毒性物质的情况下，均应谨慎处理。

使用超低温冰箱或液氮罐进行冻存、复苏操作时，务必注意安全，以免发生冻伤。建议操作者至少穿戴保温手套或橡胶手套。

从液氮复苏细胞时，冻存管可能吸入液氮，在升温过程中可能发生爆炸，尤其是用安瓶管做冻存管时。因此，要求融化速度尽可能地快。建议使用辅料镊夹持冻存管。最好操作者穿戴有面部防护头罩。