[实验器材]

CO2培养箱，倒置显微镜，低速冷冻离心机，超净工作台，液氮罐，普通冰箱，-80℃超低温冰箱，离心管，冻存管，长丝滴管，添加有0.02%EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液，DMSO,10%BS培养液，废液缸，酒精棉球。

［操作步骤］

1．以10%BS培养液配制成含10%DMSO的溶液作为冻存液，或从-20℃冰箱取出冻存液并平衡到室温。建议新鲜配制。

2．对数生长期细胞的吹打收集或胰蛋白酶消化收集，离心和计数。

3.800-1000r/min离心6min，收集细胞沉淀。

4．加入适量细胞冻存液，制备单细胞悬浮液，调整细胞密度在106-107个／ml范围。

5．上述细胞悬液分装入1.8ml冻存管中，装量1.0-1.5ml/支，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容（图10-7)。

6．冻存子超低温冰箱：直接放入，或4℃冰箱放置30min后放入。记录放置的具体位置，如冻存盒编号、冻存盒内位置。

7．冻存于液氮储罐：直接放入瓶颈内经30min后再放入正常位置，或4℃冰箱放置30min后放入瓶颈内经30min后再放入正常位置。记录放置的具体位置，如提架编号、冻存盒编号和盒内位置。

［注意事项]

1．冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24h内对培养液进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。

2．冻存液的配方可根据细胞种类的不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5％-20％之间调整。

3．最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。

4．应戴手套操作，DMSO有毒，使用液氮罐或超低温冰箱时，防止冻伤。