【原理】用不同浓度的实验试剂将细胞处理2小时，经胰蛋白酶消化后，以低密度接种，1-3周后染色计数集落数。

【材料】

1．培养液。

2．消化液0.25%胰蛋白酶。

3.D-PBSA。

4．待测物质配制成最大使用浓度的10倍，溶于无血清培养液中。

5．培养瓶，25cm2。

6．培养皿，6cm或9cm。

7．甲醇。

8.1％结晶紫。

9．血细胞计数板或电子细胞计数器。

【操作步骤】

1．准备一系列在25cm2的培养瓶中培养的细胞，6组试剂浓度，每组各3瓶，另有3组作为对照。在每个培养瓶中接种4.5ml细胞悬液（细胞浓度为每毫升生长液5×104个细胞），温育48小时，届时细胞将进入对数生长期。

2．制备一系列待测物质的稀释液，每组2m1,为所需终浓度的10倍。

(1)若是首次测试的化合物，在3-5个对数生长范围内采用5倍稀释。

(2）若是能够预测大致的毒性浓度，那么就选择一个较窄的算术范围，每组相隔10或20数量级。

3.在每组浓度的3个培养瓶中各加入0.5ml10倍浓度的待测化合物，使其稀释10倍，先从对照组（不含待测物质）开始，然后从低浓度向高浓度进行。

4．若待测物质作用缓慢或可部分逆转，可以将细胞暴露在待测物质中3天，每日更换培养基及待测物质，这样培养基及待测物质都可得以更新。对于快速作用的物质，暴露1小时就已足够。

5．依次将每组3瓶中的培养液倾去（从最低浓度向最高浓度进行），用胰蛋白酶消化细胞。

6．将细胞稀释至克隆生长所需的浓度，接种于培养皿中。以与对照组相同的数量稀释所有细胞，从最高浓度的培养瓶至最低浓度组，最后稀释对照组。孵育细胞直至集落形成。

7．用无水乙醇固定细胞，1％结晶紫染色。

8.用自来水清洗培养皿，吸去水分，倒置干燥。

9.对多于50个细胞的集落（多于5个世代）进行计数。

10．计算每组药物浓度下的细胞贴壁效率每组浓度的贴壁率／对照组的贴壁率，这是细胞存活分数。

11．依据所用的浓度范围，在对数或线性药物浓度下，绘制细胞存活分数曲线图。

12．确定IC50或IC90，它们分别是50％或90%的集落形成被抑制时的化合物浓度。由于这是一个半对数曲线图，IC90更为适用，因为它更可能落在曲线的线性部分；而IC50往往落在曲线的弯曲部分，这样它的稳定性就比较差。

13．敏感性差异曲线的分析

(1)曲线的斜率和弯曲部分的长度：曲线的斜率较浅和（或）弯曲部分较长表示敏感性降低；斜率较陡和（或）弯曲部分较短表示敏感性增加。弯曲部分的长度及斜率对IC50和IC90均有影响，而在IC90可以观察到更显著的差异，并且IC90常作为一个简单的导数。

(2）抗性分数：细胞抗性分数是指曲线下端的平坦部分。

(3)缺乏曲线梯度则表示所有细胞均有抗性。

(4)曲线下面积：复杂的生存曲线可以通过计算曲线下的面积进行比较。