一、实验原理

当前茶饮料因其具有一定的保健功能而非常流行，其中主要的有效成分是茶叶提取物，茶叶（Tea）提取物中含有咖啡因（Caffeine)。咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，有提神醒脑的作用，是一种中枢神经兴奋剂。同样含有咖啡因成分的咖啡、可乐等软饮料及能量饮料在市场上亦十分畅销，但长期、大量饮用有成瘾的趋势。此外，咖啡因也是世界上最普遍使用的精神药品之一，我国将咖啡因列为“精神药品”加以管制。

咖啡因的测定方法以高效液相色谱法为主，通过色谱柱将咖啡因与样品基体组分分离，用紫外检测器测定其含量。在高效液相色谱法中应用最为广泛的是反相色谱，即流动相的极性大于固定相。本实验以非极性的C18键合相色谱柱、极性的甲醇／水流动相分离样品中咖啡因，使用紫外检测器，以色谱峰面积为定量分析指标，计算饮料中咖啡因的含量。

二、主要仪器和药品

高效液相色谱仪（C18反相键合相色谱柱4.6 mm x15 cm，微量注射器）、紫外检测器（波长254 nm)。

流动相：甲醇：水＝60:40，流速0.5 ml·min^-1.

咖啡因（分析纯）、储备液（配制成咖啡因1000 mg·ml^-1的甲醇溶液）、甲醇（色谱纯）、实验用水使用纯水机制取。

三、实验步骤

1．标准溶液配制

将咖啡因储备液用甲醇稀释成浓度分别为20、40、80、120、160 mg·L^-1的标准系列，备用。

2．样品处理

依据样品状态不同，采取相应的处理方法。常用的样品处理方法如下：

①取100 ml液态饮料（特别是可乐等碳酸饮料）于250 ml干燥烧杯中，经超声脱气5 min,驱除其中C0₂等气体，依其含量适当稀释。

②准确称取固态咖啡0.25 g（准确至0.0001g)，水溶解，定容100.0 ml，摇匀备用。

③准确称取茶叶0.3 g（准确至0.0001g) ,30 ml水煮沸10 min，冷却后将上清液转移至100 ml容量瓶中，重复上述过程两次，定容并摇匀备用。

分别取上述试液5 ml，用0.22 um滤膜过滤，滤液置于洁净、干燥的具塞容器中，供色谱分析用。

3．咖啡因含量测定

(1)色谱条件的选择

预热仪器并系统初始化，柱温为室温， C18反相键合相色谱柱4.6 mm x15 cm，紫外检测器，波长254 nm；流动相甲醇:水=60:40，流速0.5 ml·min^-1；进样量为5ul。

(2）咖啡因标准系列的测定

待基线平稳后，分别取5ul浓度为20、40、80、120、160 mg·L^-1标准系列进样，测量其峰面积；并重复一次，取其平均值，绘制标准曲线。

(3)试液测定

取制备好的试液5 ul，进样并测量其峰面积；并重复两次，取其平均值，计算含量。

4．数据处理

(1)绘制标准曲线

根据标准系列峰面积数据与其浓度数据，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，并考察其线性关系。

(2)计算样品中咖啡因的含量

根据试样咖啡因峰面积数据，在标准曲线查出其咖啡因浓度，最终换算成原始样品中咖啡因的含量。

四、注意事项

试样的进样体积可根据其试样中咖啡因含量而调整。若含量较低，可以加大进样体积，以峰形对称、峰面积数值大约位于标准曲线中值处为宜。