一.包装

包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再进行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、金属盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸等将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其他物品可参照处理。

1．瓶皿类硫酸纸罩以瓶口，外罩两层牛皮纸用绳扎紧。

2．小平皿、胶塞、刀剪等器械可装入金属饭盒再以牛皮纸包装，绳扎好。

3．吸管、滴管类吸管和滴管的接口塞堵上脱脂棉（松紧度适宜），装入消毒筒内；滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用方型包布包好，绳扎好。

4．无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。

目前，多数实验室都采用一次性的商品化用材，包括无菌衣、帽和口罩，一次性培养板和瓶皿等（表1-2），免去了上述繁杂的处理过程，使用方便。

二.消毒灭菌

消毒与灭菌贯穿组织细胞培养的各个环节，必须严格认真，以防发生污染。包括操作面与空间、培养器具和培养用液的灭菌等。其方法分为物理法、化学法和生物法等。物理法指干热、湿热、滤过、紫外线及射线等；化学法指使用化学消毒剂和防腐剂等：生物法指应用抗生素和抗真菌剂等。

1．干烤适用于玻璃器皿，160～170℃,90～120分钟或180℃45～60分钟。金属器械、橡胶和塑料制品不能使用。

2．高压蒸气灭菌用于玻璃器皿、滤器、橡皮塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等。因物品不同其有效灭菌压力和时间不同，如某些培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃）高压灭菌10分钟；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃）高压灭菌15℃20分钟。压力与温度的相关性见表1-3。

清洗器材包装灭菌后容易出现消毒的与未消毒的相互混淆，为了防止混淆带来的严重后果，可在包装后，用密写墨水在包装表面做好标记，即用毛笔等蘸水以密写墨水〔密写墨水的配制：氯化钻（COC1₂·6H₂0)2g,30％盐酸l0ml,蒸馏水88ml〕在包装上做一记号，未经灭菌的这种墨水不带痕迹，凡经高温处理后，密写墨水即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒灭菌过。

3.滤过除菌适用含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为200～450nm大小的滤板可除去细菌和真菌等，用200nm孔径的滤板通过两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。

滤器分为抽滤（负压）式和加压式两种，抽滤式滤器与抽滤瓶相连，用真空泵抽气形成负压使液体滤过。由于抽气造成负压抽吸，使用时要注意防止倒流而引起污染，关键是在抽气时应使气体缓慢回流，即先用止血钳夹住抽气管后再关机，防止气体回流；加压式滤器为密闭式容器，加人待滤过的液体后，通过气体（通常用N₂,0₂或C0₂）造成容器内压力将液体滤过，使用时注意压力不得过大，不应超过20kPa。常用滤器有：

(1)蔡氏滤器：蔡氏滤器为不锈钢的金属结构，中间夹有一层石棉制成的一次性纤维滤板，滤板有一定厚度，承压力较好，是过滤血清等黏稠液体较理想的滤器。滤板规格为EKS₁,EKS₂,EKS₃等，国产板分甲1、甲2、甲3，EKS₃与甲3除菌效果好。

(2）玻璃滤器：该滤器为漏斗状的玻璃制品，中间是一层高温烧结的玻璃滤板，固定于漏斗的内壁上。规格为G₁～G₆，其型号的孔径大小与用途见表1-4。细胞培养一般采用G₅和G₆，过滤时滤器的过滤装置见图1-5，可用于过滤除血清等较黏稠液体以外的各种培养用液，可有效过滤除菌。玻璃滤器只能采用抽滤式，而且抽滤的速度较慢，滤器的清洁与灭菌处理较麻烦。

(3）微孔薄膜滤器：当需滤过的溶液是很难得到并且其量很少时，可选用注射器微孔薄膜滤器，结构与蔡氏滤器一样，中间夹着一层很薄的纤维素酯薄膜，其孔径规格有600nm,450nm和220nm三种，以220nm薄膜滤过除菌的效果最好。由于滤膜较薄且光滑、易移动，滤器的上、下层相应部位各设一个凹槽以放置一硅胶垫圈，便于固定滤膜。安装滤膜时应注意正确放置，而且要将滤膜的光面向上，滤器不宜安装过紧，以免将滤膜挤压破裂。当用微孔薄膜滤器过滤较大量（500～1000ml)液体时，可选用直径为10cm或15cm的滤器，通常使用两层滤膜，上层为450nm，下层为220nm，以确保过滤安全可靠。若过滤小量液体（数毫升内）时，可选用直径2.5cm的滤器，以注射器的推动压力过滤液体（图1-4)。目前实验室广泛应用无菌包装的一次性微孔薄膜滤器，有用于连接加压蠕动泵过滤较多液体的和直接连接注射器过滤少量液体的两种滤器可供选择。

4．紫外线紫外线直接照射用于消毒实验室内空气及操作台表面，有时对不耐热的塑料培养皿和微孔反应板等的处理，也可用紫外线直接照射。在房间内紫外线灯的安装不宜高于2.5m，一般在进入无菌室之前或做完实验后，均开灯照射20～30分钟进行消毒；若照射台面上的培养皿或其他物品时，被照物距紫外线灯距离0.5～lm，直射30～120分钟。紫外线消毒必须直射，否则会存有死角。

5．射线主要指⁶⁰CO、加速器等发出的y射线，用于不耐热的塑料制品或一次性用品的灭菌。一般将物品清洗干净、晾干后，用塑料袋封闭包装，再摆放于包装纸箱内，用20000～100 000rad的γ射线照射其灭菌效果最可靠。

6．熏蒸消毒实验室、无菌室、超净工作台内或C0₂孵箱内的消毒可用甲醛蒸气熏蒸，遇有上述空间出现污染致细胞出现污染时，或实验室两个月一次的常规消毒等，均可用高锰酸钾5～7.5g，加甲醛10～15 ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间须密闭24小时，至少要封闭4小时以上。

7．化学消毒剂常用碘酊、乙醇擦手及擦拭培养瓶盖和外壁等；来苏、苯扎溴铵、过氧乙酸等用于实验室、无菌室的桌面、物体表面的消毒，或放消毒缸内使用。

8．生物法消毒应用抗生素进行消毒，预防污染。不同种类抗生素适用于杀灭或抑制不同微生物，适用于培养用液。常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素等。作用的对象主要是细菌。现在还没有对抗支原体有效的抗生素。可将受支原体污染的组织细胞接种于同种动物的皮下或腹腔中，借动物的免疫系统除去支原体，此方法称作动物体内接种除菌法。