（一）目的基因的获取与纯化

1．目的基因的获取要克隆某一基因并将其导入培养细胞，首先需分离并制备目的基因。获取目的基因的方法可通过基因组文库或cDNA文库信息分离筛选基因，然后用人工方法合成基因，并应用PCR扩增技术获取目的基因。

2．质粒DNA的纯化在进行细胞转染时，不论用何种转染方法对质粒DNA的纯度要求都比较高。质粒DNA应当是无蛋白质、无RNA和化学试剂污染，OD260/OD280应在1.8以上。下面介绍质粒DNA纯化的具体方法。

【材料】

(1) 1xTE缓冲液：含10mmol/L Tris-HCI,lmmol/L EDTA(pH 7.4）的溶液。

(2)氯仿与异戊醇混合液：两者的比例为24:1(V/V)。

(3)平衡酚：取经过重蒸的苯酚，加入等体积的Tris-HCI缓冲液（pH 8.0 )，在分液漏斗中反复振荡，并加入少量固体Tris。待酚相和水相分开后，测定酚相的pH. pH大于7.5者为合格。

【方法】

(1）取质粒DNA 5～10ug,溶于100ul三蒸水中。

(2）加等体积平衡酚振荡1分钟。室温下以10 OOOr/min离心5分钟。

(3）将上清液移至另一新Eppendorf管中，加等体积氯仿与异戊醇混合液，振荡10分钟。室温下以10 OOOr/min离心5分钟。

(4）将上清液移至另一新Eppendorf管中，加入1/10体积的3 mmol/L醋酸钠(pH 5.0)，再加入2.5倍体积的无水乙醇。

(5）置液氮中10分钟或于-20℃静置2小时，然后4℃下，20 OOOr/min离心5分钟。

(6)倒掉上清液，再加入70％乙醇。4℃下，15OOOr/min离心10分钟。离心后将乙醇倒掉。

(7)将Eppendorf管置超净台上吹干。然后，溶于1xTE缓冲液，备用。

3．目的基因与载体的连接利用DNA连接酶将目的基因片段和载体DNA连接在一起，成为一个新的重组分子，这就是DNA的体外连接。目的DNA片段被限制性内切酶消化后，其末端只可能有三种形式：①带有相同黏性末端；②带有非互补的黏端；③带有平末端。与载体DNA可出现不同的连接后果。

【材料】

(1）试剂：0.5mol/L EDTA、乙醇、TE (1Ommol/L Tris-HCI, pH 8.0, 1mmol/L EDTA,pH 8.0)、线性目的基因，T4连接酶与配套缓冲液。已经酶切处理过的线性化载体、10x小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase,CIP),lOxCIP缓冲液；

(2)器材：移液器、移液器头（Tip头）,Eppendof管、水浴箱等。

【方法】

(1)黏性末端连接：为防止载体DNA自身环化，在连接前需除去载体分子5’端磷酸，使之最大程度地抑制载体环化现象。

1）建立下列去磷酸基团的反应系统：线性化载体10ul, CIP 0.5ul,10×CIP缓冲液2ul,双蒸水7.5ul, 37℃水浴15分钟。再加入CIP 0.5 ul，置55℃水浴45分钟。加入2 ul 0.5mmol/L EDTA，于65℃灭活15分钟。乙醇沉淀，TE溶解。

2）建立连接体系：在0.5m1 Eppendof管中加入线性化目的基因（0.4ug)4u1，载体DNA（经CIP处理后）1ul,1OXCIP缓冲液1 u1,T4 连接酶1 ul，加双蒸水至10u1。置16℃水浴12～16分钟。

(2)平黏端连接

1)制备目的基因DNA酶切片段（如两端均为EcoR I端）；

2)制备载体DNA酶切片段（如一端为EcoR I 黏端，一端为其他酶切的黏端）；

3)用T4连接酶连接匹配的黏性末端（线性化目的基因与载体DNA中间，用T4 DNA连接酶加以连接），另一端不匹配无法连接。

4)用Klenow补平不匹配的黏末端：目的基因和线性载体DNAO.5ul,l0x大肠埃希菌DNA聚合酶I的Klenow片段1 u1, 2mmol/L dNTP 2u1，加双蒸水至20 u1。置37℃水浴1分钟。

5）乙醇沉淀，溶于7ul TE液中，取5ul TE，加1 ul连接缓冲液，1ul连接酶，双蒸水13 ul，作用16～20分钟。

6)电泳后观察：取2ul TE反应液，经电泳后与连接前的TE作对照，观察连接效果，并估计含量。取适量进行细胞内基因转化实验。

（二）待转染细胞的准备

常用的待转染细胞主要是已建立的细胞系，如HeLa,CHO,CV-1,HK细胞等。根据研究的需要也可用原代细胞。细胞的培养过程以及培养基的配制、培养的具体条件等与一般细胞的培养操作完全相同。但是，基因转染对细胞的生长状态和密度有特定的要求，在实验中要加以注意，通过预试确定待转染细胞最佳生长状态和密度。例如，根据经验，在用Ca²⁺转染时，以处于旺盛分裂期、相互之间留有少量空隙的细胞转染率为最高。原因为：①沉淀在细胞表面的DNA-Ca3 (P03)2复合物对细胞有一定毒性作用，分裂旺盛的细胞对这种毒性作用抵抗能力强；②分裂旺盛的细胞对DNA一复合物吞噬能力比老化的细胞强；③转染后的细胞迅速恢复分裂能力，留有少量空隙的目的是给转染后的分裂细胞保留适当的空间，使细胞有良好的生长环境。下面就待转染细胞的准备作一简述。

【材料】

1．培养器皿的准备细胞培养所用的培养瓶皿、血清瓶、吸管、离心管等均须经去污剂清洗、烘干后于清洁酸液内浸泡过夜，取出后在清水中漂洗干净，以66.7 kPa高压灭菌20分钟后备用。处理的详细过程可见第二章第二节，清洗的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹。

2．培养基的配制多数实验室采用RPMl 1640和DMEM培养液。配制的培养基用5.6% NaHC0₃溶液调pH至7.0～7.2，然后加入10％小牛血清和青霉素50～l00IU/ml,链霉素50～100 ug/ml。最后用0.22 um的微孔滤膜过滤除菌。分装于l00ml血清瓶，于4℃保存备用。

【方法】

1．贴壁细胞的传代

(1)待细胞生长接近铺满培养瓶壁时，倒掉培养液。

(2)在培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶溶液，消化1～5分钟（要注意每种细胞适用的消化酶的种类、浓度和消化时间不同，必要时应当用预实验加以确定）。然后用吸管吹打使细胞分散。

(3)收集细胞悬液，于台式离心机上以1500r/min离心5分钟，沉淀细胞，倒掉消化液。

(4)将细胞沉淀转入新的培养瓶中，并加入新鲜培养液。然后按1:2或1:3分瓶培养。

2．悬浮细胞的传代

(1)待细胞生长接近满培养瓶时，收集细胞悬液，于台式离心机上以1500r/min离心5分钟，沉淀细胞，倒掉消化液。

(2）将细胞沉淀转入新的培养瓶中，并加入新鲜培养液。然后按1:2或1:3分瓶培养。

挑选边缘整齐、无折光颗粒，处于对数生长期的细胞作转染。