神经干细胞（neural stem cells, NSCs）的发现为中枢神经系统损伤性疾病的治疗及其伤后功能重建带来了新的希望。研究发现，移植到中枢神经系统的NSCs能够继续存活并迁移、分化，而且成年NSCs在体内外均可分化为具有生物活性的神经元。

NSCs原代取材的常用供体主要为鼠胚胎和成年鼠，供体年龄和取材部位都会对NSC的纯度产生影响。鼠胚胎大脑皮质中的NSC，数量明显高于新生鼠和成年鼠，而且具有更强的保持未分化状态和体外扩增的能力，这说明成年鼠体内NSCs的分化潜能明显低于鼠胚胎体内的NSCs，其中又以胎龄12～14天的鼠胚胎体内NSCs的分化能力最强，因此，12～14天鼠胚在神经干细胞的培养中最为常用。

一、神经干细胞的分离与培养

从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的神经干细胞具有增殖能力，可进行传代培养，获得的细胞克隆中巢蛋白（nestin )表达阳性，透射电镜可见典型的干细胞特征和不对称分裂现象。贴壁分化后可见微管相关蛋白（microtubule-associated protein-2, MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达阳性的细胞。

【材料】

1．组织来源 孕12～14天的Wistar大鼠。

2．培养用试剂 无钙镁PBS(CMF-PBS)

3．培养基配方和制备 DMEM/F12培养液，添加1 % N₂,2% B27,20ug/LEGF和20 ug/LbFGF。

4．实验器材 眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、解剖显微镜、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀、显微剪、显微镊。

【方法】

1．取材孕12～14天的Wistar大鼠，腹部备皮，无菌条件下行剖宫产术，胎鼠置于预冷的PBS中，冲洗3次。解剖显微镜下，显微器械剥离头部皮肤、软脑膜及血管等。取大脑，在含有DMEM/F12的培养液中，用眼科剪将其充分剪碎。

2．分离细胞将上层液体移入离心管中，1000r/min，离心5分钟。用巴斯德吸管轻柔吹打数次，使之成为细胞悬液，过100目的尼龙滤网。

3．接种与培养细胞计数，将细胞以2x10⁶/ml密度接种入培养皿，放入37℃,5% CO₂培养箱中，饱和湿度常规培养。直至NSCs增殖形成神经球后再换液。首次传代后每3天半量换液。

【结果】

细胞接种于培养皿后24小时，可见细胞散在分布，接种后3～4天，可见大小不等的细胞团，即克隆球形成，球体边界较清晰，折光性强（图6-3)。免疫荧光染色结果显示，P4NSCs球体轮廓清晰，nestin表达为阳性。

【注意事项】

应用机械分离法获取神经干细胞，大脑剪碎过程要在冰上操作，从而获得足够数量的细胞。

二、神经干细胞的鉴定

神经干细胞是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞，从细胞形态来看，神经干细胞为圆形或椭圆形，核质比大，细胞核染色深，在形态上与其他种类的细胞没有明显的差异。目前未找到特殊的细胞表面标志物，利用神经干细胞的自我更新能力及多分化潜能来鉴定神经干细胞，是目前应用最为广泛的一种鉴定方法。

（一）大鼠NSCs的自我更新能力鉴定-nestin检测

【材料】

1．组织来源取第4代悬浮生长的大鼠NSCs

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS)。

(2) 4％多聚甲醛磷酸缓冲液

3．试剂配方和制备4％多聚甲醛磷酸缓冲液，2％山羊血清封闭液。

4．实验器材眼科弯镊，盖玻片。

【方法】

1．固定PBS冲洗3次，4％多聚甲醛磷酸缓冲液固定2小时。

2．封闭PBS冲洗3次，0.5 % Triton X-100室温孵育10分钟，2％山羊血清封闭液封闭30分钟～1小时。

3．抗体孵育加1:200兔抗-nestin抗体，置湿盒内，4℃过夜；以不滴加一抗的PBS作为阴性对照。PBS冲洗3次，加入FITC标记的羊抗兔IgG(1:200),37℃孵育30分钟～1小时。PBS冲洗3次。

【结果】

NSCs呈神经球样生长，nestin是NSCs的特征性标志之一。免疫荧光染色结果显示，P4NSCs球体轮廓清晰，nestin表达为阳性。

【注意事项】

NSCs接种后6～8小时，吸出培养液，室温下晾干，防止神经球脱落。

（二）大鼠NSCs的多分化潜能鉴定

【方法】

1．固定 PBS冲洗3次，4％多聚甲醛磷酸缓冲液固定2小时。

2．封闭 PBS冲洗3次，0.5 % Triton X-100室温孵育10分钟，2％山羊血清封闭液封闭30分钟～1小时。

3．抗体孵育加1:200兔抗-MAP-2/GFAP抗体，置湿盒内，4℃过夜。PBS冲洗3次，加入FITC标记的羊抗兔IgG(l:200),37℃孵育30分钟～1小时。PBS冲洗3次。

【结果】

添加20％胎牛血清的NSCs诱导培养液中培养，诱导24小时后，光镜下观察，悬浮生长的神经球开始贴壁，球体边缘处细胞伸出突起进入分化状态，细胞生长旺盛，可见不同形态的细胞从细胞团边缘中长出，诱导2天后，细胞伸出突起，细胞呈散在分布，诱导4天后，大量细胞从神经球中长出，分化的细胞具有神经元、神经胶质细胞的形态特征。

【注意事项】

4％多聚甲醛磷酸缓冲液4℃固定2小时后，PBS充分清洗。