1. 3H-TdR掺入法

【原理】

IL-2的生物活性测定需要稳定、敏感的IL-2测定细胞。IL-2测定细胞大体可分为两大类：一类是IL-2依赖性细胞株（CTLL-2 )。其特点是只有在IL-2存在的培养条件下才能生长，否则会在24小时内死亡；另一类为新鲜制备的对IL-2有反应性的淋巴母细胞，这类细胞在IL-2存在的培养条件下生长能力增强，但无IL-2存在时并不死亡。这类细胞可替代第一类IL-2的检测。在培养过程中，加入待测溶液，如果细胞能够生长，表明待测标本中有IL-2。为了获得较好的特异性，常使用IL-2依赖性细胞株（CTLL-2)。

【材料】

IL-2依赖性细胞株有CTLL-1和CTLL-2两株IL-2依赖性细胞。前者来自正常C57BL/6小鼠的脾细胞，后者来自白血病细胞免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞。使用CTLL细胞株检测IL-2活性具有简便、敏感、稳定、特异等优点。但也存在某些问题，如CTLL细胞对各种影响其生长的因素较为敏感，长期培养有一定难度。因此掌握CTLL细胞株的培养技术及培养特性十分重要。

【方法】

CTLL细胞的培养条件：CTLL细胞需要在含有IL-2的培养基中才能生长，因此最好用纯化的重组IL-2饲养CTLL细胞。纯化IL一浓度为50～100U/ml，培养液为含10％小牛血清的RPMI 1640，在37℃ 5% C0₂中悬浮培养。一般隔2～3天换液一次。细胞浓度影响检测效果，起始细胞浓度为（2～5)x10⁴/ml，终止浓度为（1～5)x10⁵/ml较为适宜。传代时间在40～48小时较为适宜。如细胞密度大应尽早传代。但在缺乏重组IL-2时，就应制备含有IL-2的大鼠因子（rat factor, RF)。RF的制备方法如下：

无菌取SD大鼠脾脏制备悬液，经低渗法去除混杂的红细胞，用Hanks液将细胞洗涤两次后，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基（含有2mmol/L谷氨酰胺，5x10^-5 mol/L a-巯基乙醇,20mmo1/L HEPES,l00ug/ml链霉素，100u/ml青霉素）将细胞悬液配成5x10⁶/ml细胞悬液。置37℃,5% CO2中培养24小时，经离心（2000r/min, 20分钟）取细胞培养上清液即为RF，过滤后置-20℃冻存备用。饲养CTLL细胞时用15％～20% RF，一般CTLL细胞在含10％小牛血清的RPMI 1640或IMDM中均可较好生长，培养器皿可采用24孔培养板或不同规格的玻璃瓶均可。

IL-2生物活性测定操作常规：

(1）将IL-2标准品用10% RPMI 1640液稀释至100U/ml，置-70℃保存备用。

(2)待测样品用10％小牛血清RPMI 1640液稀释至与标准品相近浓度。

(3）用微量加样器往96孔培养板每孔中加入10％小牛血清RPMI 1640液100ul，每排第一孔则分别加入标准品和待测样品100ul，各设3个复孔。

(4）将标准品和待测样品倍比递次稀释，对照孔只加10％小牛血清RPMI 1640液100ul。

(5)用等体积的无血清RPMI 1640液洗涤CTLL-2细胞3次，1000r/min离心10分钟。然后调整细胞浓度至105/ml。

(6）用微量加样器每孔加入100u1细胞悬液。将96孔板放置37℃,5% CO₂孵箱中培养20小时。

(7）取出96孔板，每孔加入37kBq的3H-TdR，再置37℃,5% C0₂孵箱中作用6小时。

(8)取出96孔板，用细胞收集器收集细胞，每孔冲洗15次。

(9)将收集纸晾干或50℃烘干，然后剪下放入闪烁瓶中。每瓶加入3 ml闪烁液，用液体闪烁计数仪测定cpm值。

根据测定结果，取3孔的平均值做曲线（横坐标为稀释倍数，纵坐标为测定的cpm值），计算结果。

在Y轴取标准品cpm50％最大值处做X轴的平行线，再分别从该平行线与标准品与样品曲线交点处做Y轴平行线，再从它与X轴的交点可找出标准品与样品cpm50％最大值的2n值。
若标准品浓度为100U/ml，样品预稀释倍数为10000倍。

【注意事项】

(1)利用透析法除去IL-2样品种的抑制因子，以提高检测的准确性。

(2)检测前CTLL细胞必须洗净以去除残留IL-2。

2. MTT比色法

CTLL-2是IL-2依赖性T淋巴细胞株，在IL-2存在的条件下才能增殖分裂。本方法以MTT为底物，MTT能够被线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原形成蓝色的甲臜，根据甲臜的多少(OD值），反应细胞的增殖情况。

【材料】

(1) CTLL-2是一株来源于小鼠的IL-2依赖细胞株。

(2) PRMI 1640细胞培养液：内含2mol/L谷氨酰胺、25mol/L HEPES、青霉素100U/ml,链霉素100 ug/ml及10％灭活小牛血清；

(3) MTT：用PBS配成lmg/ml使用液，4℃避光；

(4) PBS-G：含0.5％葡萄糖磷酸缓冲液(PBS)O.02mol/L,pH 7.2;

(5) IL-2标准品：活性为500U/ml；二甲基亚砜(DMSO。

【方法】

(1)制备CTLL-2细胞悬液：收集生长良好的CTLL-2细胞，用RPMI 1640细胞培养液1500r/min离心5分钟洗涤细胞2次，并制成细胞悬液，用0.5％锥虫蓝液染色检测细胞存活率（应95％以上），调整细胞浓度至1x10⁵/ml。

(2）加样：将标准样品及待测样品作倍比稀释，按每孔100u加入96孔平底细胞培养板中，每个稀释度3个复孔，然后，每孔加CTLL-2细胞悬液100ul，另设3个对照孔，只加100ul细胞和100ul培养液，37℃ 5% CO₂条件下培养32～40小时，轻轻吸弃上清液100ul，加入MTT溶液50ul，于振荡器上振荡混匀1分钟，放置37℃ 5% C0₂孵育箱内反应2小时，取出培养板，弃上清液，每孔加入DMSO 120ul，振荡30秒后，在酶标仪540nm处读取OD值。

【结果】

3．刀豆蛋白A诱导T细胞微量测定法

刀豆蛋白A (ConA）可使T淋巴细胞转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞为IL-2反应细胞，可表达丰富的IL-2受体，该细胞可在体外连续培养并与IL-2含量呈试剂依赖关系。它对有丝分裂素（如ConA）无反应性或反应极微。因此，在无CTLL细胞株的情况下可用该细胞做IL-2检测。

【材料】

C57BL/6小鼠、ConA，其余同上。

【方法】

(1) ConA诱导IL-2反应细胞的制备：将C57BL/6小鼠脾脏磨碎配成5x106/ml的单细胞悬液。加入ConA5 ug/ml，置5% CO₂,37℃培养40～48小时。将培养的细胞悬液置于淋巴细胞分离液上，1700r/min离心15分钟，取界面层细胞即为IL-2反应细胞（淋巴母细胞），此细胞均为呈多角形的大淋巴细胞。小淋巴细胞为静止期，少于5%。

(2）将上述反应细胞配成1x10⁶/ml浓度的悬液，取100ul加入96孔板各孔中，再加入100 ul待测样品或标准品，置37℃,5% CO₂孵箱中培养40～48小时，每孔再加入0.5 uCi³ H-TdR继续培养4～6小时。用多头细胞收集器收集细胞，再用液体闪烁计数仪测定核素掺入量。

【注意事项】

此法简单易行，可省去饲养CTLL细胞的许多麻烦，但由于动物的个体差异往往会造成很大的批间差异。另外淋巴母细胞的诱导和分析技术不易掌握，有时易混入较多的静止期小淋巴细胞，这些细胞对ConA仍有反应性。因此，作为检测的母细胞中所含的小细胞不宜超过5%，并且在实验系统中应设立ConA反应对照组。