叶绿素是植物光合作用的重要光合色素，常见的有叶绿素a、b、c、d四种类型，其中叶绿素a是一种能将光合作用的光能传递给化学反应系统的唯一色素，叶绿素b、c、d等吸收的光能均是通过叶绿素a传递给化学反应系统的。通过测定叶绿素a，可掌握水体的初级生产力，了解河流、湖泊和海洋中浮游植物的现存量。试验表明，当叶绿素a质量浓度升至10 mg/m³以上并有迅速增加的趋势时，就可以预测水体即将发生富营养化。因此，可将叶绿素a含量作为评价水体富营养化并预测其发展趋势的指标之一。

叶绿素a的测定方法有高效液相色谱法、分光光度法和荧光光谱法。高效液相色谱法精确度高，但操作步骤烦琐。目前最常用的是分光光度法和荧光光谱法。

1．分光光度法测定叶绿素a

(1)基本原理。

叶绿素a的最大吸收峰位于663 nm，在一定浓度范围内，其吸光度与其浓度符合朗伯-比尔定律，可根据吸光度-浓度之间的线性关系，计算叶绿素a的浓度。叶绿素b、叶绿素c和提取液浊度的干扰可通过分别在645 nm、630 nm和750 nm处测得的吸光度校正。水样中的浮游植物采用过滤法富集，用有机溶剂提取其中的叶绿素。

根据所用提取液的不同，叶绿素a的分光光度法测定可分为丙酮法、甲醇法和乙醇法等。我国一直沿用丙酮法。近年来国际上从萃取效果和安全保障等方面考虑，已逐渐改用乙醇法。

(2)测定方法及要点。

①丙酮法：该方法适合于藻类繁殖比较旺盛的水样和表面附着的藻类。

a．样品的制备及叶绿素的提取：离心或过滤浓缩水样，用质量分数为90%的丙酮溶液提取其中的叶绿素。

将一定量的水样用乙酸纤维滤膜过滤，将收集有浮游植物的滤膜于冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器，加入少量碳酸镁粉末及2～3 mL质量分数为90％的丙酮溶液，充分研磨，提取叶绿素a，离心，取上清液。重复提取1～2次，离心所得上清液合并于容量瓶，用质量分数为90％的丙酮溶液定容(5 mL或10 mL)。

b．测定：取上清液于1 cm比色皿中，以质量分数为90％的丙酮溶液为参比，分别读取750 nm ,663 nm,645 nm和630 nm的吸光度。

c．计算：叶绿素a的质量浓度按如下公式计算：

式中;V—水样体积，L;

A—吸光度；

V₁—离心并合并后上清液定容的体积，mL;

δ—比色皿光程，cm。

②乙醇法：其测定原理与丙酮法相同，不同的是以体积分数为90％的热乙醇溶液提取样品中的叶绿素。方法要点如下：

a．样品制备：过滤一定体积(V)的水样，将滤膜向内对折，于-20℃的冰箱中至少保存一昼夜。

b．叶绿素提取：从冰箱中取出样品，立即加入约4 mL体积分数为90％的热乙醇溶液，80～85℃水浴保温2 min后于室温下避光萃取4～6h，玻璃纤维滤膜过滤，收集滤液井定容至10 mL (V1)。

c．测定：以体积分数为90％的热乙醇溶液为参比，分别测定样品在665 nm和750 nm的吸光度A665和A750，然后在样品中加入1 mol/L的盐酸酸化，混匀，1 min后重新测定前面两个波长处的吸光度A'665，和A'750。

d.计算：样品中的叶绿素a质量浓度按下式进行计算：

P.(叶绿素a) (mg/m³)=27.9 V₁×[(A₆₆₅-A₇₅₀)-(A'₆₆₅-A'₇₅₀)]/V

2．荧光光谱法测定叶绿素a

方法原理：当丙酮提取液用436 nm的紫外线照射时，叶绿素a可发射670 nm的荧光，在一定浓度范围内，发射荧光的强度与其浓度成正比，因此，可通过测定样品丙酮提取液在436 nm紫外线照射时产生的荧光强度，定量测定叶绿素a的含量。

该方法灵敏度比分光光度法高约两个数量级，适合于藻类比较少的贫营养化湖泊或外海中叶绿素a的测定。但是分析过程中易受其他色素或色素衍生物的干扰，并且不利于野外快速测定。