梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k'，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性的分离。梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，并可改善检测器的灵敏度。当样品中第一个组分的k’值和最后一个峰的k'值相差几十倍至上百倍时，使用梯度洗脱的效果就特别好。此技术相似于气相色谱中使用的程序升温技术，现已在高效液相色谱法中获得广泛的应用，它可以低压梯度和高压梯度两种方式进行操作。

1.低压梯度(外梯度)

在常压下将两种溶剂(或多元溶剂)输至混合器中混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中，其装置如图9-13所示。此法的主要优点是仅需使用一个高压输液泵。

图9-13  低压梯度
1-低压计量泵；IA,IB-时间比例电磁阀；2-微处理机；3-混合器；4-高压输液泵；5-至色谱柱

如对二元混合溶剂体系，操作时先将弱极性溶剂A，通过由微处理机控制的低压计量泵和时间比例电磁阀I_A，直接流入混合器；另一种强极性溶剂B，也通过低压计量泵，并由微处理机控制另一时间比例电磁阀(I_B)的开关时间，来调节流入混合器的B溶剂的体积分数，以控制输出混合溶剂的组成。溶剂A和B在混合器内充分混合后，再用高压输液泵输至色谱柱。通过预先设定开启溶剂A、B时间比例电磁阀的运行程序，就可控制二元混合溶剂流动相的组成，并连续输出具有不同极性的流动相。此种梯度洗脱方式可以减小溶剂可压缩性的影响，并能完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化所带来的误差。

高效液相色谱仪用一台双柱塞往复式串联泵和一个高速比例阀构成的四元低压梯度系统，如图9-14所示。

2．高压梯度(内梯度)

目前，大多数高效液相色谱仪皆配有高压梯度装置，它是用两台高压输液泵将强度不同的两种溶剂A、B输入混合室，进行混合后再进入

图9-14  Agilent 1200高效液相色谱仪的四元低压梯度系统
1-溶剂1；2-溶剂2；3-溶剂3；4-溶剂4；5-高速比例阀；6-双柱塞往复式串联泵

色谱柱。两种溶剂进入混合室的比例可由溶剂程序控制器或计算机来调节。此类装置如图9-15所示，它的主要优点是两台高压输液泵的流量皆可独立控制，可获得任何形式的梯度程序，且易于实现自动化。

图9-15  用两个高压泵组成的高压溶剂梯度
1-程序控制器；2-溶剂A；3-溶剂B；4-高压泵A；5-高压泵B；6-反馈控制器；7-混合室；8-流量计信号；9-混合溶剂出口

HPLC色谱仪的二元高压梯度系统如图9-16所示。

由于高压梯度装置中，每种溶剂是分别由泵输送的，进入混合器后，溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积的变化，可能影响输入到

图9-16  HPLC色谱仪的二元高压梯度系统
1-溶剂入口单向阀；2-溶剂出口单向阀；3-阻尼器；4-混合器；5-清洗阀；6-至进样器和色谱柱

色谱柱中的流动相的组成。

在梯度洗脱中为保证流速稳定，必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。