在高效液相色谱分析中梯度洗脱的功能相似于气相色谱分析中的程序升温，它对改善色谱分离的效果，可发挥重要作用。梯度洗脱可提高分离度、缩短分析时间。对组成复杂的混合物，特别是不同组分的容量因子(k')范围宽、保留值相差较大的混合物，使用梯度洗脱是最适宜的。

1．影响梯度洗脱的各种因素

(1)梯度洗脱时间(t_G)对分离的影响图9-64表示含有7个组分的样品，由相同起始时间进行梯度洗脱，并且强洗脱溶剂B在流动相中的浓度变化范围(10％～60％)也完全相同，仅梯度洗脱时间t_G不同，分别为5min、10min、20min、40min，可以看到随梯度洗脱时间t_G的延长，组分间的分离度R增加，总分析时间延长，由此可确定当满足一定分离度(如R=1.0)的前提下，梯度洗脱时间不宜太长。

图9-64  梯度洗脱时间(t_G)对分离的影响

(2)梯度陡度(T)对保留值的影响梯度陡度T定义为：

式中，T为在单位时间流动相中强洗脱溶剂组分B的浓度变化速率，％min; △φ为梯度洗脱中强洗脱溶剂组分B体积分数(％)的变化量。

梯度陡度T增加可缩短梯度洗脱时间，但也降低了各组分间的分离度；反之，若T减小，可改善各组分间的分离度，却延长了总的分析时间。因此在梯度洗脱中梯度陡度的选择既不能太大，也不能太小，其数值适中才能获得满意的分离效果。

(3)强洗脱溶剂组分B浓度变化范围的影响进行梯度洗脱时，选择强洗脱溶剂B的浓度变化范围(即最初和最终的φ_B数值)应依据下述原则：

①样品流出的谱峰不要太靠近色谱图的开始处(即k'≈0)，最好第一个谱峰的保留时间为死时间t_M的2倍。

②在梯度洗脱结束前，所有组分都从色谱柱中洗脱出来。

③在色谱图的开始和结束，无浪费的保留时间。

(4)梯度洗脱程序曲线形状的影响在梯度洗脱中，当确定了t_G,溶剂浓度的变化范围和T后，所确定的梯度洗脱条件代表了对样品中所有组分实现分离的最佳条件。如果样品中有两组最关键的色谱峰对，使用一个梯度陡度洗脱仍不能达到完全分离(R=1.5)，则此时可以改变梯度洗科程序曲线的形状，即在一个梯度洗脱中，采用两个不同梯度陡度，从而使两组关键色谱峰对的分离度均获得进一步的提高。

基于相似的考虑，如在一个梯度洗脱中，聚集在谱图中间部分的组分过于密集，未能实现理想的分离，此时也可改变梯度洗脱程序曲线的形状，由一阶梯度洗脱改变成二阶梯度洗脱，即在有两个梯度陡度的一阶梯度洗脱的中间部分加入适当时间间隔的等度洗脱部分，这样就可使谱图中间部分的组分色谱峰获得理想的分离。

2.梯度洗脱应注意的问题

(1)空白梯度在样品进行梯度分离之前，必须进行一次空白梯度，即不注入样品，仅按梯度洗脱程序运行得到的基线。空白梯度试验是在与样品梯度洗脱程序完全相同的条件下进行，此时会存在基线漂移并出现杂质峰。

此外，流动相中强洗脱溶剂B，也应使用高纯HPLC级，以减小杂质含量。通常在反相色谱中使用的甲醇、四氢呋喃、乙腈改性剂中，乙腈因来源和精制工艺的原因，往往含杂质较多。

(2)色谱柱中流动相的平衡当每次梯度洗脱分析结束时，流动相的组成已和梯度洗脱开始时大不相同，为了进行下一次的梯度洗脱，必须用起始的流动相对色谱柱彻底平衡后，再重新开始梯度洗脱程序。

如对妙φ46cm×25cm的色谱柱，用5％～100％的乙腈-水溶液进行梯度洗脱，洗脱结束后至少需要15～20倍柱死体积的起始流动相充分洗脱后才可达到柱平衡，此柱的死体积V_m = 2.5mL，此时最少需要2.5×15mL=37.5mL, 5％乙腈-水溶液流过柱子，才可开始下一次梯度分析。实践表明，用起始流动相使色谱柱平衡周期足够长，才能获得重现性好的谱图。

对色谱柱进行平衡再生的时间通常约等于梯度时间t_G，这意味着会加倍延长每个样品的分析时间。由于色谱平衡主要受再生溶剂体积的影响，因此可用增加再生溶剂流速的方法来缩短柱平衡时间。也有文献提出使用反向梯度来缩短柱再生时间。

柱平衡时间不足时，将呈现色谱图中早期洗脱峰的保留时间发生改变，而后期洗脱谱峰一般不受影响。也应防止用于柱再生溶剂流过柱的体积过大，而造成色谱柱吸附再生溶剂中的杂质，引起柱分离性能的改变。当进行反相色谱梯度洗脱时，最好从5％或超过5％的有机相(B)开始，可缩短柱平衡时间；若从纯水开始梯度洗脱，则色谱柱就需较长的平衡时间。

(3)线性梯度洗脱的滞后现象当确定了线性梯度洗脱程序后，从t=0开始梯度洗脱实验操作，但由于实现梯度洗脱的仪器设备结构或电子控制系统的多种原因，使实际观测到的梯度洗脱是向后平移了一段时间，称为梯度系统的滞后时间，用t_D表示。

线性梯度洗脱的滞后现象如图9-65(a)所示。若使用相同的线性梯度洗脱程序，对同一个样品，在不同的高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，由于仪器结构和电路控制的差异，其表现出的梯度洗脱系统的滞后时间t_D各不相同。即使用同一台仪器，对同一个样品进行分析，若使用不同设置的梯度洗脱程序(如t_D、△_φ、T不相同)，由于水和有机溶剂互混后引起的体积微小变化，也会使滞后时间t_D发生变化。在低压梯度情况下，当溶剂混合比例阀至色谱柱入口之间的滞留体积V_D为2～6mL时，若流动相的流速F= 2mL/min，则滞后时间t_D=V_D/F，为1～3min。对高压梯度仪器，通常V_D为1～3mL，此时t_D值会更小些。当使用t_D值不同的设备时，通常会导致组分峰的保留时间发生变化，但各组分峰的相对位置却不会发生明显的变化。

另由图9-65 (b)可看到，在梯度洗脱开始与结束处的轮廓应为直线，但实际上却变成了圆滑的虚线。这是由于水和有机溶剂的混合不是在无限小的空间内完成的，而是在具有一定体积的梯度混合器内实现的，并与脉动阻尼器和连接管路的体积相关，这些体积增大，梯度洗脱开始与结束处的轮廓会更圆些，这就使梯度洗脱的线性变差。因此，梯度洗脱轮廓线的线性程度和开始与结束两端的弯曲程度，可作为评价HPLC系统梯度洗脱线性优劣的判别标准。

图9-65  线性梯度轮廓
(a)由仪器t_D引起的梯度滞后；(b)由系统内扩散使梯度弯曲