填充色谱柱的方法，根据固定相微粒的大小有干法和湿法两种。微粒大于20um的可用干法填充，要边填充边敲打和振动，要填得均匀扎实。直径10um以下的柱，不能用干法填充，必须采用湿法。

湿法装柱又称等密度匀浆装填法。此法常用对二氧六环和四氯化碳，或四氯乙烯和四溴乙烷等溶剂，按待用固定相的密度不同，采用不同的溶剂比例，配成密度与固定相相似的混合液为匀浆剂。如对硅胶固定相，可使用由四溴乙烷(20份)、对二氧六环(15份)、四氯化碳(15份)，或由四溴甲烷(60.6％)与四氯乙烯(39.4％)组成的匀浆剂。对氧化铝固定相，可使用由四溴乙烷(9份)、对二氧六环(1份)组成的匀浆剂。然后用匀浆剂把固定相调成均匀的、无明显结块的半透明匀浆，脱气后装入匀浆罐中。开动高压泵，打开放空阀，待顶替液从放空阀出口流出时，即关闭阀门，调节高压泵，使压力达到30～50MPa打开三通阀，顶替液便迅速将匀浆顶入色谱柱中，匀浆剂、顶替液通过柱下端的筛板，流入废液缸。如图9-61。当压力下降到10～20 MPa时，说明匀浆液已被顶替液置换，柱子已装填完毕。但不能马上关掉高压泵，需要逐渐降低压力，匀速降至常压后停泵，卸下柱子，装在进样器上即可。

图9-61  湿法匀浆装柱示意图

所用匀浆剂及顶替液应根据固定相的性质选定，并进行脱水处理。一般情况，硅胶、正相键合固定相用己烷作顶替液，反相键合相、离子交换树脂用甲醇、丙酮作顶替液。

干法装柱与气相色谱法相似：在柱子的一端接上一个小漏斗，另一端装上筛板，保持垂直，分多次将固定相倒入漏斗装入柱中，并轻敲管柱直至填满为止；除去漏斗，再轻顿柱子数分钟，至确认已装满，然后装好筛板，接上高压泵，在高于使用的柱压下，用载液冲洗半小时，以逐去空气。

在匀浆装填法中常用作匀浆剂的一些溶剂的密度和黏度如表9-22所示。

表9-22  作为匀浆剂的一些溶剂的性质

①卤代烷均有毒，它们的毒性特别大。

色谱柱填充后，应做出柱性能评价，评价的方法是测定色谱柱的理论塔板数n、色谱峰的不对称因子A_s和柱压力降△p，并用有代表性的样品绘出相应的分离谱图。

1．理论塔板数

此式适用于对称的色谱峰，当实验条件达最佳化时，柱效n可达最大值n_max

式中，L为柱长，cm; d_p为粒径，um。

对用5um固定相填充的25cm的色谱柱，其n_max可达20000。当分析实际样品时，n比n_max要小，在使用过程，柱的n值也会减小，当进样达1000次后，柱效会下降50％，此时应对色谱柱进行再生处理。

在理想最佳分离条件下，不同粒度固定相装填不同长度的色谱柱，其最高柱效如表9-23所示。

表9-23  不同粒度与长度色谱柱最高柱效

2．不对称因子

对拖尾峰或前沿峰可用不对称因子A_s表达其不对称的程度，可按图9-62表达的方法，按下式计算色谱峰的A_s:

新色谱柱色谱峰的A_s值为0.9～1.1之间，当其A_s为1时表明色谱柱填充良好，色谱峰对称。当A_s值远大于1.0或远小于1.0时，表明柱填充情况较差、色谱系统的柱外效应严重，或因操作不当引起色谱柱头塌陷(见图9-63)，或样品与固定相发生不可逆的化学反应等。若改变实验操作条件仍不能减小A_s值，应重新装填色谱柱。

图9-62   A_s的计算法
峰不对称因子

图9-63  柱头对峰形的影响
(a)正常；(b)、(c)柱头塌陷

3．柱压力降

一根10～25cm的色谱柱，填充5～10um的固定相，使用黏度η为0.5～1.5mPa·s的流动相，色谱柱的压力下降△P为6～15MPa。若柱压力降△p偏低且柱效很差，表明柱未填充好，不宜使用；若柱压力降△P偏高，表明柱头多孔不锈钢烧结片或孔径0.45um的纤维素滤膜被堵塞，应及时更换，以降低柱压力降。

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