(2)高灵敏度的双光路双流路荧光检测器。HPLC的荧光检测器是最常用的检测器之一；具有灵敏度高、选择性好等优点。它除了能对天然荧光物质进行检测外，对许多本身不发荧光的物质，也可用所谓“外源荧光法”进行检测；例如，用这种方法可检测低达10^-12 g的各种氨基酸。1973年，日本的H. Haten。等首先报道了单光路荧光检测器，对硫酸奎宁的最小检测量为10^-12 g。接着，美国的J. Steiehen在1974年研制成功了单光路的荧光/吸收两用检测器；荧光检测部分的最小检测量也达到10^-12 g。

①双光路双流路荧光检测器有如下优点：第一，不需要光反馈，就可以抵消光源波动和光电倍增管暗电流对测量的影响；第二，可以抵消溶剂和石英池表面引起的拉曼(Raman)、瑞利(Rayleigh), T铎尔(Tyndal)散射光的影响；第三，各类石英受到265～330nm波长的光激发时，在800nm处会产生不同强度的荧光，即使是用汞灯的254nm或365nm较弱的光激发，仍会产生，这在单流路仪器中较难消除，只有在双流路中才容易消除。双光路双流路的缺点是体积较大，制造比较困难。

② FD-1型双光路双流路荧光检测器：为了解决氨基酸、多肤蛋白质、核苷酸等研究工作的需要，作者研制成功了FD -I型双光路双流路荧光检测器，于1980年8月通过了专家鉴定，并且此后得到了成功的应用，作者也因此获得中国科学院的科技进步奖。

FD-1型荧光检测器的工作原理如图2-57所示。激发的紫外光源L发出的光分成两路，分别照射在样品池C_S和参考池C_R上；不进样时，两个池流过的流动相相同，发出的荧光和拉曼、瑞利等散射光的强度相等，放大器输出为零样品进入样品流路时，样品池发出的荧光强度大于参考池的荧光强度，两者转变成电信号，经放大器作减法运算和放大后，输送给记录仪，得到试样的荧光强度。

图2-57 FD-1型双光路双流路荧光检测器工作原理框图

作者研发的FD-1型荧光检测器的主机，由光源(低压汞灯和高压汞灯)、非球面石英强聚光镜、石英样品池、紫外和可见光滤光片以及光电倍增管R₄₅₆组成。

FD-1型荧光检测器的汞灯电源非常重要，对整机的稳定性影响很大。HPLC的检测器不稳定90％左右是由于电源不稳定引起的。

HPLC检测器使用的光电倍增管，对高压电源要求很高。作者研制的FD-1型荧光检测器采用的R₄₅₆光电倍增管，其高压电源是作者研制的。其主要性能技术指标为：输出高压：-450～-1000V；输出电流为0～4mA；电压调整率为5×10^-5；高压漂移开机4小时后为6×10^-5，开机6小时后为5×10^-5；动态内阻小于1Ω；纹波电压约0.2mV。

FD-1型检测器的光路结构比较简单，每路只用一块单片强聚光镜，减少了光学元件和机械部件；放大器和光电倍增管负高压电路简单可靠，稳定性好。

FD-1型荧光检测器1980年研发成功，同年由原南京分析仪器厂投产。1982年获中国科学院科技进步奖。

作者用FD-1型荧光检测器，与美国同期同类型的仪器比较如表2-8所示。

表2-8 FD-1与美国同期Fluoro Monitor的比较

③应用实例。作者用自己研制的FD-1型荧光检测器，和中国科学院上海有机化学研究所的陆缢华教授，对多种发荧光的物质进行了检测，都得到了满意的结果。主要应用实验(测试)结果如下。

a. Dansyl-Len的定A测试。

色谱柱：YWG80-5，166×5mm；压力：48kg/cm²；流速：FR=FS=1.4mL/min；流动相：丙酮，pH=4.8(冰乙酸)；仪器条件：最灵敏量程；记录仪：5mV挡；纸速：8mm/min；样品量: 2 uL(浓度1.325×10^-7g/uL)。测试图如图2-58所示。

图2-58 Dansyl-Len的定量测试

b. Dansyl-Leu、Dansyl-Gly、Dansyl-Ser混合样品的分离。

色谱柱：YWG80-5，166×5mm；压力：50kg/cm²；流速：FR=FS=0.7mL/min；流动相：氯仿：异戊醇：冰乙酸=70：30：3, pH=4.8(冰乙酸)；仪器条件：最灵敏量程；记录仪：5mV挡；纸速：4mm/min；样品量 : Dansyl-Leu、Dansyl-Gly、Dansyl-Ser混合样品＝0.4：7.5：7；进样8uL。混合样品的分离谱图如图2-59所示。

图2-59 Dansyl-Leu、Dansyl-Gly、Dansyl-Ser混合样品的分离谱图

c．核糖核昔的分析。核苷中双氢脲嘧啶没有紫外吸收，本身也不发荧光，因此对双氢脲嘧啶的分析检测是一个比较困难的工作，主要是找不到合适的分析仪器。因此，作者研制的FD-1型荧光检测器是首选的最佳仪器。利用FD-1型荧光检测器，采取“外源荧光法”对DNSGLY酰腺核苷腙进行的定量分析，最小检测，达到5×10^-11g。仪器条件：进样1 uL(浓度4.84×10^-7g/uL)，流速：0.7mL/min；流动相：乙腈：二甲基亚砜：乙酸＝30：20：1.5。分析测试结果如图2-60所示。

图2-60 核糖核苷的分析(手动进样，进样时停泵)

相关链接：HPLC几种最常用的主要检测器（一）