(一)荧光法

1．原理

样品经混合酸消化后，硒化合物被氧化为四价无机硒( Se⁴⁺)，与2,3-二氨基萘(2,3-Diaminonaphtkhalene，简称DAN)反应生成4,5-苯并苤硒脑(4,5-Benzo piasel-enol)，其荧光强度与硒的浓度在一定条件下成正比。用环己烷萃取后于激发光波长376nm,发射光波长520nm处测定荧光强度，与绘制的标准曲线比较定量。本方法检出限为3ng。

2．试剂

除非另有规定，本方法所使用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。

(1)硒标准溶液准确称取元素硒(光谱纯)100.0mg,溶于少量浓硝酸中，加入2mL高氯酸(70％～72%)，至沸水浴中加热3～4h，冷却后加入8.4mL HCl(盐酸浓度为0.1 mol/L)。再置沸水浴中煮2min。准确稀释至1000mL，此为储备液(Se含量：100 ug/mL)。使用时用0.1mol/L盐酸将储备液稀释至每毫升含0.05ug硒。于冰箱内保存，两年内有效。

(2) DAN试剂(1.0g/L)此试剂在暗室内配制。称取DAN(纯度95％～98%)200mg于一带盖锥形瓶中，加入0.1 mol/L盐酸200mL，振摇约15 min使其全部溶解。加入约40 mL环己烷，继续振荡5 min。将此液倒入塞有玻璃棉(或脱脂棉)的分液漏斗中，待分层后滤去环己烷层，收集DAN溶液层，反复用环己烷纯化直至环己烷中荧光降至最低时为止(约纯化5～6次)。将纯化后的DAN溶液贮于棕色瓶中，加入约1cm厚的环己烷覆盖表层，至冰箱内保存。必要时在使用前再以环己烷纯化一次。

警告：此试剂有一定毒性，使用本试剂的人员应有正规实验室工作经验。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关规定的条例。

(3)混合酸将硝酸与高氯酸按9:1体积混合。

(4)去硒硫酸取浓硫酸200mL缓慢倒入200 mL水中，再加入48%氢溴酸30mL，混匀，至沙浴上加热至出现白浓烟，此时体积应为200mL,

(5) EDTA混合液

① EDTA溶液(0.2mo1/L)：称取EDTA二钠盐37g，加水并加热至完全溶解，冷却后稀释至500mL。

②盐酸羟胺溶液(100g/L)：称取10g盐酸羟胺溶于水中，稀释至100mL。

③甲酚红指示剂(0.2g/L)：称取甲酚红50mg溶于少量水中，加氨水(1+1)1滴，待完全溶解后加水稀释至250mL。

④取EDTA溶液(0.2mo/L)及盐酸Y胺溶液(100g/L)各50mL，加甲酚红指示剂(0.2g/L) 5mL，用水稀释至1L，混匀。

(6)氨水(1：1)。

(7)盐酸(1：9)。

(8)环己烷需先测试有无荧光杂质，否则重蒸后使用，用过的环己烷可回收，重蒸后再使用。

3. 仪器设备

(1)荧光分光光度计。

(2)天平感量为1 mg。

(3)烘箱、粉碎机、电热板、水浴锅。

4．检测步骤

(1)样品处理

①粮食：试样用水洗三次，至60℃烤箱中烘去表面水分，用粉碎机粉碎，贮于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。

②蔬菜及其他植物性食物：取可食部，用蒸馏水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，不锈钢刀切碎，取一定量试样在烘箱中于60℃烤干，称重，计算水分。粉碎，备用。

计算时应折合成鲜样重。

③其他固体试样：粉碎、混匀试样，备用。

④液体试样：混匀试样，备用。

(2)试样消化称含硒量约为0.01～0.5ug的粮食或蔬菜及动物性试样0.5～2g(精确至0.001g)，液体试样吸取1.00～10.00mL于磨口锥形瓶内，加10mL 5％去硒硫酸，待试样湿润后，再加20 mL混合酸液放置过夜，次日置电热板上逐渐加热。当剧烈反应发生后，溶液呈无色，继续加热至白烟产生，此时溶液逐渐变成淡黄色，即达终点。某些蔬菜试样消化后出现浑浊，以致难以确定终点，这时可注意瓶内出现滚滚白烟，此刻立即取下，溶液冷却后又变为无色。有些含硒较高的蔬菜含有较多的Se⁶⁺，需要在消化完成后再加10mL 10%盐酸，继续加热，使再回终点，以完全还原Se⁶⁺为Se⁴⁺，否则结果将偏低。

(3)测定上述消化后的试样溶液加入20.0mL EDTA混合液，用氨水(1 :1)及盐酸(1:9)调至淡红橙色(pH 1.5～2.0)。以下步骤在暗室操作：加DAN试剂(1.0g/L)3.0mL,混匀后，置沸水浴中加热5 min，取出冷却后，加环己烷3.0mL，振摇4 min，将全部溶液移入分液漏斗，待分层后弃去水层，小心将环己烷层由分液漏斗上口倾入带盖试管中，勿使环己烷中混入水滴，于荧光分光光度计上用激发光波长376nm、发射光波长520nm测定4,5-苯并苤硒脑的荧光强度。

(4)硒标准曲线绘制准确量取标准硒溶液(0.05 ug/mL) 0.00、0.20、1.00、2.00、4.00mL，相当于0.00、0.01、0.05、0.10、0.20ug硒，加水至5.0mL后，按试样检测步骤同时进行测定。

当硒含量在0.5 ug以下时荧光强度与硒含量呈线性关系，在常规测定试样时，每次只需做试剂空白与试样硒含量相近的标准管(双份)即可。

5.结果计算

式中x—试样中硒含量，ug/g或ug/mL;

m₁—试管中硒的质量，ug；

F₁—标准硒荧光读数；

F₂—试样荧光读数；

F₀—空白管荧光读数；

m—试样质量，g或mL。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

相关链接：食品中锌的测定(原子吸收光谱法)

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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