(二)高效液相色谱法

液相色谱法适用于饮料类、蜜饯凉果、果丹类、话化类、带壳及脱壳熟制坚果与籽类、配制酒、水果罐头、果酱、糕点、面包、饼千、冷冻饮品、果冻、复合调味料、腌渍蔬菜、腐乳等食品中环己基氨基磺酸钠的测定。

1.测定原理

食品中环己基氨基磺酸钠用水提取后，在强酸性溶液中与次氯酸钠反应，生成N,N-二氯环己胺，用正庚烷萃取后，利用高效液相色谱法检测，保留时间定性，外标法定量。

2. 试剂和仪器

(1)试剂

①正庚烷[CH₃(CH₂)₅CH₃]和乙腈(CH₃CN)：均是色谱纯。

②石油醚：沸程为30～60℃。

③硫酸溶液(1+1)：50mL硫酸小心缓缓加入50mL水中，混匀。

④次氯酸钠溶液：用次氯酸钠稀释，保存于棕色瓶中，保持有效氯含量50g/L以上，混匀，市售产品需及时标定，临用时配制。

⑤碳酸氢钠溶液(50g/L)：称取5g碳酸氢钠，用水溶解并稀释至100mL ,混匀。

⑥硫酸锌溶液(300g/L)：称取折合30g硫酸锌，溶于水并稀释至100mL,混匀。

⑦亚铁氰化钾溶液(150g/L)：称取折合15g亚铁氰化钾，溶于水并稀释至100mL,混匀。

⑧环己基氨基磺酸钠标准储备液(5.00mg/mL)：精确称取0.5612g环己基氨基磺酸钠标准品(纯度≥99%)，加水溶解并定容至100mL，此溶液1.00mL相当于环己基氨基磺酸5.00mg。置于1～4℃冰箱中保存，可保存12个月。

⑨环己基氨基磺酸钠标准中间液(1.00mg/mL)：准确移取20.0mL环己基氨基磺酸钠标准储备液用水稀释并定容至100mL置于1～4℃冰箱中可保存6个月。

⑩环己基氨基磺酸钠标准曲线系列工作液：分别吸取标准中间液0.50、1.0、2.5、5.0、10.0mL至50mL容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为10.0、20.0、50.0、100、200ug/mL、临用现配。

(2)仪器和设备

①液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

②超声波振荡器、样品粉碎机、恒温水浴锅、天平(感量1mg、0.1mg)。

③离心机：转速≥4000r/min。

3．测定步骤

(1)试样溶液的制备

①固体和半固体类试样处理：称取均质后试样5.00g于50 mL离心管中，加入30 mL水，混匀，超声提取20min，离心(3000r/min)20min，将上清液转出，用水洗涤残渣并定容至50mL备用。含高蛋白类样品可在超声提取时加入2.0mL硫酸锌溶液和2.0mL亚铁氰化钾溶液。含高脂质类样品可在提取前加入25 mL石油醚振摇后弃去石油醚层除脂。

②液体类试样处理：普通液体试样摇匀后可直接称取样品25.0g，用水定容至50mL备用(如需要可过滤)。

含CO₂的试样：称取25.0g试样于烧杯中，60℃水浴加热30min以除去CO₂，放冷，用水定容至50mL备用。

含酒精的试样：称取25.0g试样于烧杯中，用NaOH溶液调至弱碱性pH 7～8, 60℃水浴加热30min以除去酒精，放冷，用水定容至50mL备用。

含乳类饮料：称取试样25.0g于50 mL离心管中，加入3.0mL硫酸锌溶液和3.0mL亚铁氰化钾溶液，混匀，离心分层后，将上清液转出，用水洗涤残渣并定容至50mL备用。

(2)衍生化准确移取10mL已制备好的试样溶液，加入2.0mL硫酸溶液、5.0mL正庚烷和1.0mL次氯酸钠溶液，剧烈振荡1 min，静置分层，除去水层后在正庚烷层加入25 mL碳酸氢钠溶液，振荡1 min。静置取上层有机相经0.45um微孔有机相膜过滤，滤液备用。

(3)色谱条件色谱柱：C₁₈柱，5um, 150mm×3.9 mm (i.d)，或同等性能的色谱柱。

流动相：乙腈＋水(70+30) ;流速：0.8mL/min;进样量：10uL;检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长：314nm。

(4)标准曲线的制作移取10mL环己基氨基磺酸钠标准系列工作液，按上述方法衍生化。取过0.45um微孔有机相膜过滤后的溶液10uL分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作溶液的浓度为横坐标，以环己基氨基磺酸钠衍生化产物N,N-二氯环己胺峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

(5)样品的测定将衍生化后的试样溶液10 uL注入液相色谱仪中，保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到试样定容溶液中环己基氨基磺酸的浓度，平行测定次数不少于两次。

4．结果计算

式中X—试样中环己基氨基磺酸的含量，g/kg;

P—由标准曲线计算出试样定容溶液中环己基氨基磺酸的浓度，ug/mL;

m—试样质量，g;

V—试样的最后定容体积，mL ;

1000—由ug/g换算成g/kg的换算因子。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。精密度要求在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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