河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)是豚毒鱼类中的一种神经毒素，为氨基全氢喹唑啉型化合物，分子式C₁₁H₁₇O₈N₃，相对分子质量319.27。TTX是一种毒性极强的天然毒素，经腹腔注射对小鼠的LD₅₀为8.7ug/kg，其毒性是氰化钠的1000多倍。TTX除在豚毒鱼类中广泛存在外，在两栖动物、软体动物、棘皮动物及甲壳动物等近百种动物中也广泛存在。TTX作为一种钠离子通道阻断剂具有镇痛和解毒等生理功能。TTX主要分布于河豚鱼的肝脏、卵巢、血液和皮肤中。肌肉一般视为无毒，但如鱼体死后时间较长，内脏和血液中的毒素将会慢慢渗人到肌肉中，引起中毒。河豚毒素的毒力单位一般以鼠单位(MU)表示，即在30min内杀死一只20g左右的雄性ddy小鼠的毒素量，根据每克河豚组织中所含毒素的多少，可将河豚组织的毒力分成四个等级：20000MU以上为“猛毒”或“剧毒”；2000～20000MU之间为“强毒”；200～2000MU之间为“弱毒”；100MU以下为“无毒，。据测定，在产卵期间，红鳍圆豚肝脏的毒力为24×10⁶MU，紫圆豚肝脏的毒力为65×10⁶MU，毒性剧烈。

TTX的检测方法主要有小鼠单位法、荧光分光光度法、高压液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)和液相色谱-荧光检测法等。荧光分光光度法定量测定TTX的原理是，TTX在碱性条件下水解后生成2-氨基-6羟甲基-8羟基喹唑啉(简称C₉碱)，该物质在370nm光激发下，在495 nm处有最大发射波长，通过检测该物质的荧光强度实现TTX的定量。该方法的检出限为0.34～10.0mg/L。除N,N-二甲酰胺可轻度增强荧光外，其他多种试剂对反应均无影响。ELISA法检出限低，可达到0.01mg/L,但需要制备抗TTX的特异性单克隆抗体(McAb)。本实验介绍液相色谱-荧光检测法(GB/T 23217-2008)定量测定TTX。该方法适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤、鱿鱼中河豚毒素的测定与确证。本标准方法的检出限为0.05mg/kg。

(一)检测原理

液相色谱-荧光检测法原理是样品中TTX经酸性甲醇提取浓缩后，过C₁₈固相萃取小柱净化，液相色谱柱后衍生，然后用荧光检测器测定，外标法定量。在定量前，本方法还需液相色谱-串联质谱法确证，请参照GB/T 23217-2008介绍。

(二)主要试剂与仪器

1．试剂

甲醇、乙酸、甲酸为色谱纯，其它试剂为分析纯。乙酸铵缓冲液：称取4.6g乙酸铵和2.02g庚烷磺酸钠，加入约700mL水溶解，以乙酸调节pH为5.0，以水稀释至1.0L。

4.0mol/L氢氧化钠溶液：称取160g氢氧化钠，以水溶解并稀释至1.0L。河脉毒素标准物质(tetrodotoxin，分子式C₁₁H₁₇N₃O₈，CAS 4368-28-9)：纯度≥98%。

标准储备液(100mg/L)：准确称取河豚毒素10.0mg，用少量水溶解后以甲醇定容至100 mL，该标准贮备液置于4℃冰箱中保存。标准工作液：根据需要取适量标准储备液，以0.1％甲酸水溶液+甲醇(9+1，体积比)稀释成适当浓度的标准工作液。标准工作液当天现配。基质标准工作液：以空白基质溶液配制适当浓度的标准工作液。基质标准工作液要当天配制。

2．仪器与设备

C₁₈固相萃取柱(500mg/3mL)，用前依次以3mL甲醇、3mL 1％乙酸溶液活化，保持柱体湿润，滤膜(0.2Km)及1mL离心超滤管(截留相对分子质量为3000),旋涡振荡器、超声波发生器、减压浓缩装置、固相萃取装置、真空泵(真空度应达到80kPa)、离心机(转速达4000r/min及13000r/min,配有酶标转子)、冷冻高速离心机(转速达到18000r/min，可制冷4℃)。

液相色谱仪(带有荧光检测器与柱后衍生装置)。

(三)检测步骤

1．样品制备

取出有代表性样品可食部分约500g，切成小块，放入组织捣碎机均质，充分混匀，装入清洁容器内，并标记。

2．样品保存

试样于-18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2～6℃贮存72h。

3．提取

称取5.00g匀浆样品置于50mL聚丙烯离心管中，加入20ml, 1％乙酸的甲醇溶液，旋涡振荡2min, 50℃水浴超声提取20min, 4000r/min离心5 min，取上清液，在残渣中再加入20mL 1％乙酸的甲醇溶液，重复以上步骤，合并上清液，过滤至100mL K-D浓缩瓶中，60℃旋转蒸发浓缩至近干，加人2mL 1％乙酸溶液，振荡洗涤浓缩瓶，转移至10mL聚丙烯离心管中，4℃下于18000r/min离心10min，取上清液待净化。

4．净化

将上清液以约1 mL/ min的流速过柱，用10mL 1％乙酸溶液洗脱，合并流出液与洗脱液，置于25 mLK-D浓缩瓶中，于60℃下减压浓缩至近干，用1％乙酸溶液定容1.0mL，过0.2 um滤膜，供液相色谱分析。

5．空白基质溶液的制备

称取阴性样品5.00g，按上述相同的方法操作。

6．测定条件

(1)液相色谱参考条件色谱柱：Purospher Star PR - 18r C18柱，5um , 250mm×4.6 mm(内径)或相当者；柱温：30℃；流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液(1+19)；流速：1.0mL/min；激发波长：385nm，发射波长：505nm；进样量：40.0/ uL。

(2)柱后衍生参考条件衍生溶液：4.0mol/L氢氧化钠溶液；衍生溶液流速：0.5 mL/min；衍生管温度：110℃。

(3)色谱测定根据样品中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中河豚毒素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，河豚毒素的参考保留时间约为10.3min，根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并外标法定量。

7. 确证

由于影响河豚毒素定性及定量的因素较多，在定量前，有条件的实验室还需液相色谱-串联质谱法确证，具体请参照GB/T 23217-2008介绍。

(四)注意事项

样品操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。由于河豚毒素为剧毒物质，对于可能含有河豚毒素的产品，应避免直接接触或误食，相关的器皿和器具可以采用4%碳酸钠溶液浸泡加热去毒处理。实验完成后，剩余的实验材料要妥善处理，以免造成中毒。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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