麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poison, PSP)广泛分布于全球各大海域，是一类对人类健康有较大危害的海洋生物毒素。水体中的藻类是麻痹性贝毒的主要来源，现已知海洋中有13种单细胞的甲藻类可产生麻痹性贝毒。贝类因滤食有毒藻而在体内积累素毒。PSP除存在于贻贝、石房蛤外，还见于某些扇贝、腹足类和蟹类中。PSP在水产动物体内并不是均匀分布的，而是因种类不同、器官不同而有所差异，并有明显的季节变化。对大西洋沿岸的调查表明，软体动物大多数种类的消化系统夏季含毒量最高，鳃和卵巢次之，肌肉含量较低，秋季毒含量下降。

PSP是一类四氢漂吟的衍生物，到目前为止，已经证实结构的PSP有20多种。根据基团的相似性，PSP可以分为：氨甲酰基类毒素(Carbamoyl compounds)：如石房蛤毒素(saxiltoxins, STX)、新石房蛤毒素(neosaxitoxins,neoSTX)、膝沟藻毒素1～4(gonyautox-insGTX1～4) ; N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl compounds)：如C1～4,GTX5、GTX6；脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl compounds)：如dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1～4;脱氧脱氨甲酸基类毒素(deoxydecarbomyl compounds)：如doSTX、doGTX2,3等。据报道，PSP的毒性因组分不同而差异较大，毒性较高的为氨甲酚基类，而氨甲酰基-N-磺基类毒素的毒性较低。PSP易溶于水且对酸和热稳定，在碱性条件下易分解失活。PSP是一类神经肌肉麻痹剂，其毒理主要是通过对细胞内钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。中毒的临床症状首先是外周麻痹，从嘴唇与四肢的轻微麻刺感和麻木直到肌肉完全丧失力量，呼吸衰竭而死。症状通常在5～30min出现，12h内死亡。PSP的毒性很大，与河豚毒素相当，摄入这种贝毒仅1 mg就可导致入死亡。国际许可的安全剂量为100g贝肉中含有相当于80 ug以下的STX的毒量。

PSP的检测方法主要有高效液相色谱法、小鼠单位法及细胞毒性试验法等。小鼠生物测试法是检测PSP的传统方法，经过一系列改进后，它是现在唯一国际认可的定量检测PSP方法(Association Official Analytial Chemists, AOAC)。小鼠生物测试法的优点是技术容易掌握、不需要专门的仪器设备，但检测的敏感性与小白鼠的品系关系很大，使得该方法的特异性和精确度不高。利用离子交换型层析法可分离贝类PSP中的STX、neoSTX和GTX1-6，分离的PSP组分在碱性条件下通过氧化作用，可衍生为荧光化合物。将这一氧化反应作为柱后的反应系统与HPLC相结合，即可敏感、专一地定量检测各种PSP毒素。实验证明，柱后衍生HPLC法与生物测试的结果有很好的相关性，灵敏度更高。而且，与其他的检测方法相比，最大的优点是能从少量的粗样中定量分析PSP的毒性成分。但这种方法需要不同结构的PSP毒素标准品。利用高效液相色谱一质谱(LC-MS)则可以直接对样品中的PSP进行分离、定性和定量。目前主要采用动物法测定PSP含量。本实验主要介绍小鼠单位法的测定，以掌握该方法测定贝类PSP的基本技术。

(一)检测原理

GB/T 5009. 213-2008规定了麻痹性贝类毒素的检验方法。该标准采用传统的小鼠生物法。鼠单位的定义为：对体重为20g的ICR雄性小鼠腹腔注射1mL麻痹性贝类毒素提取液，使其在15 min时杀死小鼠所需的最低毒素量。采用石房蛤毒素(saxitoxin)作为毒素的标准品，将鼠单位换算成毒素的微克数。根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位，计算确定每100g贝肉内的PSP的微克数。所测的结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素的含量。

(二)主要试剂及仪器

盐酸、氢氧化钠等均为分析纯。体重19～21g ICR品系的雄性健康小白鼠。

石房蛤毒素(saxitoxin, C₁₀HN₇O₄·2HCl)标准溶液(100ug/mL)：用蒸馏水水配制20%(体积分数)的乙醇溶液，用5 mol/L盐酸调节pH至2.0～4.0，用上述溶液配制石房蛤毒素。

(三)检测步骤

1．样品中PSP的提取

用清水将牡蛎外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来物，取出贝肉。收集约200g肉于10号筛子中沥水5min，检出碎壳等杂物后匀浆。取100g已均质的贝肉于烧杯中，加100mL 0.18mol/L的HCl溶液，充分搅拌，使pH为2.0～4.0。将混合物加热并煮沸5 min。冷却后离心5 min (3000r/min)，取上清液作为样品液。

2. PSP标准工作液的配制

精密称取10.00mg贝类毒素标准品(saxitoxin)于100mL容量瓶中用盐酸酸化的20%乙醇(pH 2～4)定容至100mL。此溶液可无限期保存。

用移液管取1mL标准液于100mL容量瓶中，用盐酸酸化的蒸馏水(pH₃)定容至100mL，配成1ug/mL的标准工作液。该溶液在3～4℃能稳定数周。分别用10、15、20、25和30mL水稀释10mL浓度为1ug/mL的标准工作液，稀释液的pH应为2～4。

3.中位数死亡时间的标准液选择

将各种稀释度的标准工作液各1mL腹腔注射数只小鼠，选择中位死亡时间为5～7min的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求，还需以1mL水的增减量进行补充实验。例如：用25 mL水稀释的10mL标准液在5～7min内杀死小鼠，还需进行(24+10)和(26+10)的稀释度试验。

以10个小鼠为一组，用中位数死亡时间在5～7min范围内的二种(最好是三种)稀释度的标准液注射小鼠。记录小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间。

每只小鼠事先称重，精确到0.5g。死亡时间的最短间隔为5s，即7s 校正为5s，8s校正为10s，如表4-1所示。

4．毒素转换系数的计算

根据所选稀释液注射的10只小鼠的死亡时间为5～7min之间的死亡时间，由表4-1和表4-2分别查出鼠单位和重量校正因子，两者相乘求得每毫升稀释液的校正鼠单位。将所选稀释液每毫升实际毒素含量的微克数(以Saxitoxin计)除以CMU值便得到毒素转换系数(CF)，即CF＝ugSAX./CMU。

计算每组10只小鼠的平均CF值，再取其组间平均值，并以此作为标准作常规检测。

5．小鼠试验

将小鼠称重并记录重量，注射三只小鼠，每只小鼠注射1mL提取液。注射完毕后用秒表记录死亡时间。若小鼠中位死亡时间小于5 min，则要进行稀释再注射另一组小鼠。

6．样品中PSP毒力计算

根据每只小鼠的死亡时间，查表4-1得出相应的每毫升注射液的鼠单位数MU，再查表4-2得出质量校正系数。质量校正系数乘以该只小鼠的MU便得到CMU。计算该组小鼠的中位数CMU(将存活鼠的死亡时间视为大于60min)。以中位数按下式计算样品中PSP的含量。

ug PSP/100g肉＝中位数CMU/mL×CF×DF×200    (4-2)

式中中位数CMU/mL—样品的校正鼠单位；

CF—由标准PSP工作液测定的毒素转换系数；

DF—样品溶液的稀释倍数。

(四)注意事项

(1) STX作为剧毒品已被收入《化学武器公约》中禁止化学品的第二类清单。STX标准品及检测到有毒的水产品应妥善处理。

(2)给小鼠做腹腔注射时应熟练操作。若有一滴以上提取液溢出就必须重新注射一只小鼠，并妥善处理所用小鼠。

表4-1 PSP死亡时间-鼠单位的关系

表4-2小鼠体重校正表

相关链接：河豚毒素的测定

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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