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贝类中腹泻性贝类毒素

发布时间:2018-09-29 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1199

腹泻性贝类毒素(Diarrhetic shellfish poison, DSP)是一类脂溶性物质,其化学结构是聚醚或大环内酯化合物。根据这些成分的碳骨架结构,可以将它们分成三组:酸性成分的大田软海绵酸及其衍生物如大田软海绵酸(okadaic acid,OA)和鳍藻毒素1-3(dinophys-istoxin, DTX1-3);中性成分的大环内酯如蛤毒素1-7(pectonotoxin, PTX1-7) ;磺化毒素成分如扇贝毒素(yessotoxin, YTX)。积累这类毒素的贝类主要有日本栉孔扇贝(Dhlamys ipponensis)、凹线蛤蜊(Mucta sulcatara)、牡蛎(Ostrea sp.)、凤螺( Strombussp)、紫贻贝(Mytilusedulis )、扇贝(Pecten albicans)、中国蛤蜊( Mactrachinensis)及蛤仔(Ruditaoes phlippinarum )等。DSP的直接生产者也是海洋藻类。能产生DSP的藻类主要是甲藻如鳍藻属和原甲藻属的一些藻类。三类毒素的毒理作用各不相同。OA对小鼠腹腔注射的半致死剂量为160ug/g,会使小鼠或其他动物发生腹泻,并且具有强烈的致癌作用。PTX对小鼠的半致死剂量为16~77ug/g,主要作用是肝损伤。磺化毒素对小鼠的半致死剂量是10ug/g,主要破坏动物的心肌。

能引起动物腹泻的DSP主要是OA和DTX1-3。中毒症状为腹泻、呕吐、腹痛和头痛。发病时间在食后0.5~14h不等,一般48h内恢复健康。一般止泻药不能医治。

检测贝类组织中DSP的方法主要是小鼠单位法,即测定小鼠急性中毒的毒量。该方法是AOAC标准方法,也是目前国家规定的标准检测方法(GB/T 5009. 212-2008 )。其测量单位是鼠单位(MU),即腹腔注射0.5~1.0mL毒素溶液,在注射后使体重16~20g小鼠致死的毒素量,定义为一个鼠单位。1MU相当于3.2 ugDTXI。这种方法不需要大型仪器,操作简单,但测定的检出限依赖于小鼠的品系,使结果的重现性差。细胞毒性试验法是基于DSP对某些细胞的毒性,能抑制其生长,毒素剂量与细胞的生长成反比。通过测定细胞的生长来测定毒素的剂量。这种方法与小鼠生物法有极好的相关性,但灵敏度较小鼠生物法差。常用的细胞有L1210小鼠白血病细胞及BGM细胞等。HPLC法是目前用于DSP不同结构组成分析及鉴定最常用的方法。利用HPLC能直接分离贝类原料中的不同结构的DSP,通过将DSP转化成荧光酯类衍生物,通过测定分离组分的荧光强度,并与DSP标准品的荧光衍生物相比较,可实现DSP的定性与定量分析。能与DSP反应生成荧光产物的化合物主要有9-蒽基叠氮甲烷(ADAM) , 4-溴甲基-6,7-二甲氧基香豆素(BrDMC)及9-氯甲基蒽(CA)等。由于ADAM极不稳定,而且价格昂贵,BrDMC的选择性不如ADAM,所以现在大多用CA作为衍生化试剂。HPLC结合质谱分析(LC-ISMS),则可直接对贝类中DSP的种类和含量进行分析鉴定。

小鼠单位法在贝类中麻痹性毒素检测时已介绍,本次介绍高效液相色谱分离荧光检测器检测分析贝类中腹泻性贝类毒素含量。

(一)检测原理

贝类组织中的DSP经甲醇提取并用CA衍生化,变成能产生荧光的衍生物,用固相萃取柱提取其中的DSP衍生物后,用反相色谱柱分离,并与标准品比较可确定贝类DSP的种类和含量。

(二)检测材料、试剂及仪器

1.检测材料

扇贝。

2.试剂

OA、DTX1标准品。

甲醇二氯甲烷正己烷无水硫酸钠9-氯甲基蒽(CA)、四甲基氢氧化胺(TMAH)、乙腈

3.仪器与设备

电动匀浆器;Beckman 114M高效液相色谱仪[Jasco 821-FP荧光检测器、Beckman210手动进样器、Supelco反相C18柱(4.6mm×150mm, 5um)];硅胶基固相萃取柱(SPE, Su-pelco,USA)。

(三)检测步骤

1. DSP的提取

将购自市场的鲜活扇贝,用刀切开闭壳肌取出贝肉,称取100g贝肉仔细切取全部中肠腺,将中肠腺匀浆。取lg匀浆后的中肠腺加6mL 80%(体积分数)甲醇后匀浆2min,离心取上清液。残渣加2mL 80%甲醇继续匀浆2min,离心取上清液。合并两次离心上清液。将上清液转入分液漏斗中用15%(体积分数)二氯甲烷/正己烷溶液脱脂三次(每次15mL),加5 mL水,再用50%(体积分数)二氯甲烷/正己烷溶液萃取三次(每次15mL),合并二氯甲烷层,用无水硫酸钠脱水后蒸发至干。用甲醇定容至1mL。得到DSP提取液。

2. DSP的衍生化

取25~50 uL样品DSP溶液于1 mL Eppendorf管中,于室温下用氮气吹干。加入400 uLTMAH溶液(0.8mmol/L,用乙腈稀释),于40℃保温2min,使DSP充分溶解。用氮气吹干。加入400uL CA溶液(0.8mmol/L,用乙腈溶解)于90℃反应lh。冷却至室温,用氮气吹干。加入300uL 50%(体积分数)二氯甲烷/正己烷溶液,溶解衍生化的DSP。

OA和DTX1标准的衍生化按上述同样进行衍生化。

3.衍生化DSP的提取

取两支硅胶基固相萃取柱,一支依次用6mL二氯甲烷和6rnL 50%(体积分数)二氯甲烷/正己烷溶液活化(记为A),另一支只用6mL二氯甲烷活化(记为B)。将300uL衍生化的DSP全部转移至A萃取柱中,同时将Eppendorf管用300uL 50%二氯甲烷/正己烷淋洗两次,并将淋洗液全部转移至A萃取柱中,弃去流出液。再分别用6mL 50%二氯甲烷/正己烷溶液和1 mL 1%甲醇/二氯甲烷溶液洗A萃取柱一次,并弃去流出液。将B柱与A柱出口相接,在A柱加7mL 5%甲醇/二氯甲烷溶液,收集B柱出口的流出液。室温下用氮气吹干,用2mL流动相溶解,供HPLC分析用。

4. HPLC分析

流动相:乙腈/甲醇(75/25,体积分数),流速1.0mL/min;激发波长:365 mm;发射波长:412nm;进样量50uL。

5. DSP组分确定及含量计算

通过与标准DSP洗脱时间对比进行定性,内标法确定含量。

(四)注意事项

(1)进行DSP的衍生化反应之前,加入TMAH的作用是TMAH与DSP形成盐,过量的TMAH会影响后续的衍生化反应。因此在加入TMAH与DSP完全反应后,要用氮气彻底除去过量的TMAH。

(2)在用固相萃取柱提纯DSP衍生物时要注意正确的活化方法。

文章来源:《食品质量与安全检测技术》

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