记忆缺失性贝类毒素(amnesic shellfish toxin, ASP)是一类存在于赤潮藻类中的硅藻属如多列尖刺菱形藻(Nitzsch pungensf.multiseries)中的毒素。中毒症状包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，同时有昏眩、昏迷等类似神经性中毒症状，永久性丧失部分记忆是此类中毒后的典型特征，因此它被称为记忆缺失性贝类毒素。ASP的主要成分是软骨藻酸(do-moicacid，简称DA)是一种具有生理活性的氨基酸类物质。因最早从红藻属的树枝软骨藻(Chondria armata)中分离出来而被命名为软骨藻酸。双壳贝类因滤食海洋微藻而积累ASP,到目前为止，已从紫贻贝(Myltilus Mulls)、扇贝(Pecten maximus )、文蛤(Callistachione)等贝类体内以及鳀鱼、鲭鱼和石蟹的内脏中检测到了软骨藻酸。美国食品药品管理局(FDA)将它确定为4种主要海洋生物毒素之一，并规定贝肉中软骨藻酸的安全剂量为20ug/g。我国也于2003年9月2日发布了GB/T 5009.198-2003《贝类记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定》。

小白鼠生物检测方法首先被应用于记忆缺失性贝类毒素的检测，该方法是AOAC标准方法。但小鼠生物法的最低检出限为50ug/g，远高于美国FDA规定的贝类食品中ASP的限量标准。为了提高贝类样品中ASP检测的灵敏度，陆续开发了以仪器分析为基础的ASP检测技术。目前，用于贝类食品中ASP检测的仪器分析法主要有高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)。用一定的溶液提取贝类食品中的ASP，用C₁₈反相高效液相色谱柱分离其中的DA。根据DA的紫外吸收特性，用UV检测器进行检测，并通过与标准DA的色谱行为进行比较完成贝类食品中ASP的定性与定量。这种方法的检出限为0.5ug/g，是小鼠生物法的100倍。将贝类的ASP提取液事先用离子交换柱去除部分杂质后，再进行HPLC分析，则检出限可提高到0.02～0.03ug/g。去除杂质后，再用荧光衍生化进行衍生化，则检出限提高到0.006 ug/g。毛细管电泳法是近几年发展起来的海洋生物毒素分离检测技术之一，它的基本原理是带电粒子因其不同的质荷比在电场中具有不同的迁移速度而得到分离。软骨藻酸分子中的官能团使其具有质子化的能力，因此它能产生带电粒子并易于毛细管电泳分离。毛细管电泳法的检出限与HPLC法相当。另外，ASP检测还有ELISA检测试剂盒。

本次实验主要介绍贝类食品中ASP的提取、纯化方法和毛细管电泳法测定贝类食品中ASP含量的方法。

(一)检测原理

贝类组织中的ASP(主要是DA)用甲醇溶液提取，并经离子交换树脂纯化，用毛细管电泳分离其中的DA，并与标准DA的电泳行为比较进行定量。

(二)主要试剂与仪器

DA标准品、MUS-1标准物质(贝类组织参照物，DA含量98ug/g)、四硼酸钠(分析纯)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)。

BioFocus 300自动毛细管电泳仪(Bio-Rad Laboratories)，配紫外检测器、组织匀浆器、高速离心机、精密pH计。

阴离子交换柱(SAX: Part No.1210-2044, Lot No.182639, Varian)、阳离子交换柱(SCX：Part No.1211-3039，Lot No. 171069，Varian)、0.45 N.,m微孔滤膜。

(三)检测步骤

1．贝类组织中ASP的提取

将购自市场的鲜活扇贝，用刀切开闭壳肌取出贝肉匀浆，取4g匀浆物加16.0mL甲醇-水(1:1，体积分数)溶液继续匀浆3 min，在4500r/min下离心10min，将上清液用0.45um微孔滤膜过滤后得到ASP粗提取液。

2.SP溶液的初步提纯

将SAX柱依次用甲醇、水、甲醇-水(1：1，体积比)预处理。取5.0mLASP粗提液加入到SAX柱使液体流出，再用5mL乙腈-水(1:1，体积分数)以1滴/s的速度洗脱杂质。最后，用5mL甲酸溶液(0.1mol/L)洗脱吸附在柱上的DA。

将SCX柱依次用甲醇、水和0.1 mol/L甲酸处理。加入5mL从SAX柱上洗脱的DA溶液，用5mL甲酸溶液(0.05 mol/L)洗去杂质。最后用6mL的硼酸钠(25mmol/L , pH9.2)-乙腈(9:1，体积分数)洗脱，收集4～6mL的含DA洗脱液用于毛细管电泳分析。

3.DA的毛细管电泳一紫外检测分析(CE-UV)

非涂渍石英毛细管柱，检测波长242nm，分离电压15.0kV，柱温25℃,压力进样41.37kPa×1s，冲洗及运行缓冲液为25 mmol/L硼酸溶液。

在两样电泳条件下，以2ug/mL的DA标准溶液进行CE-UV分析。

4．扇贝样品中DA的定性与定量

通过与标准DA的电泳行为比较进行定性，以外标法进行定量。

相关链接：贝类中腹泻性贝类毒素

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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