在食品样品的提取液中，常含大量的基体成分如蛋白质、脂肪、糖类、色素和蜡质等，在进行有机成分分析时，检测结果常常受到这些基体组分的干扰。因此，需要对样品提取液进行适当的处理，以去除干扰成分，这个处理过程称为净化(clean up)。根据样品基体、待测成分和检测方法的特点，可选择不同的净化方法。常用的净化方法有以下几种。

1．液-液分配法((liquid-liquid partition)利用待测组分和拟去除的杂质在溶解度方面的差异，选择互不相溶的溶剂对样品提取液进行净化。例如，分析高脂肪含量样品中的农药残留，可先将样品溶于正己烷或石油醚，然后加入亲水性有机溶剂进行反萃取，使脂肪等杂质仍留在正己烷层(弃去)，而待测组分进入亲水性有机溶剂中，再以正己烷萃取，可加入硫酸钠或氯化钠促进分层，从而使待测成分净化。

2．液相色谱法(chromatography)利用物质在流动相与固定相两相之间分配系数的差异，当两相做相对运动时，在两相间进行多次分配，分配系数大的组分迁移速度慢；反之迁移速度快，从而实现样品中各组分的分离。这种分离方法的最大特点是分离效率高，能使多种性质相似的组分彼此分离，是食品理化检验中一类重要的分离方法。根据操作形式不同，可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法等。

(1)柱色谱法(column chromatography)：将固定相装填于柱管内制成色谱分离柱，色谱分离过程在柱内进行。常用的固定相有硅胶、氧化铝、硅镁吸附剂、C_18、C₈、人造浮石及各种离子交换树脂等，根据待测成分和杂质的种类选择。该法操作简便，柱容量大，适用于微量成分的分离和纯化，应用较广泛。例如，采用荧光法测定食品中的维生素B₂ 时，利用硅镁吸附剂柱将维生素Bz与杂质分离；采用荧光法测定食品中的硫胺素时，利用人造浮石对硫胺素的吸附作用，让样品溶液通过人造浮石后，使硫胺素被吸附，用水洗除杂质，再用酸性氯化钾溶液洗脱被吸附的硫胺素。在进行有机氯或有机磷农药测定时，常用活性炭柱除去植物色素；用硅镁吸附剂或弗罗里硅土(florisil )柱除去蜡质和脂肪等杂质；当被处理的样品较复杂时，还可将各种固定相按一定比例混合装柱，从而达到较好的净化目的。

上样后，要选择合适的淋洗液，将待测成分顺利洗脱下来，而杂质则尽可能留在柱上。淋洗液应根据待测成分、杂质和固定相的性质来选择，可参考文献报道，也可通过条件优化实验确定。淋洗液用量不宜过大，否则可能导致色层分散，少量杂质也会洗脱下来；并且浪费溶剂和时间，给后续的浓缩过程带来困难。另外，还应控制淋洗液的流速，因为柱中达到交换平衡需要一定的时间，所以流速不宜太快；但也应避免在柱中停留时间过长，以免发生变化。

(2)纸色谱法(paper chromatography)：以层析滤纸作为载体，滤纸上吸附的水作为固定相。将样液点在层析滤纸的一端，然后用展开剂展开，达到分离目的。例如，纸色谱法用于食品中人工合成色素的分离鉴定。

(3)薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)：将固定相均匀涂铺于玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在薄层板上进行色谱分离的方法。例如，食品中黄曲霉毒素B₁ 测定的国家标准方法就是采用薄层色谱法分离后用荧光法检测。

3.固相萃取(solid phase extraction, SPE)是一类基于液相色谱分离原理的样品前处理技术，能同时达到分离、净化和浓缩的目的，是目前应用最广泛的净化方法之一。固相萃取装置一般由填充适当固定相的固相萃取小柱和辅件构成。其中小柱由柱管、筛板和填料三部分组成；辅件由真空系统、真空泵、缓冲瓶等。当样品溶液通过SPE小柱时，待测成分被吸留。在固相萃取中样品的洗脱有两种形式：一种是待测成分比干扰物质与固定相之间的亲和力更强，先用合适的溶剂洗除样品基体或干扰物质，然后再用一种选择性的溶剂将待测组分洗脱下来；另一种是干扰物质较待测组分与固定相之间的亲和力更强，待测组分被直接洗脱下来，而干扰物质不被洗脱，从而达到分离和富集待测成分的目的。该方法方便快速，简化了样品预处理过程，具有使用有机溶剂少、重现性好、易于实现自动化等优点，在痕量分离中应用广泛。

固相萃取主要由以下几个操作步骤：第一步，柱的预处理(即固定相的活化)。为了获得较高的回收率和良好的重现性，固相萃取柱在使用前必须用适当的溶剂进行预处理，以除去柱填料中可能存在的杂质，另外也可以使填料溶剂化，从而提高固相萃取的重现性：第二步，加样。样品溶液被加入SPE柱，待测成分被保留于固定相。第三步，淋洗：在样品通过SPE柱时，不仅待测物被吸附在柱子上，某些杂质也同时被吸附，选择适当的溶剂，将干扰组分洗脱下来，待测组分仍留在柱上；或将待测成分直接洗脱下来，杂质留在柱上。后者可直接用于分析。第四步，待测成分的洗脱。用选择性溶剂将待测组分洗脱在收集管中，直接用于测定或进一步浓缩后备用。

根据分离的原理不同，SPE可分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤、配合和亲和萃取。其中采用化学键合反应制备的固相材料，如C₁₈键合硅胶、C₈键合硅胶、苯基键合硅胶等填装的固相萃取小柱使用广泛。除传统的固相填料外，免疫亲和柱也能用于食品样品的净化。例如，牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂的液相色谱-荧光检测，将黄曲霉毒素的特异抗体交联在固体支持物上制成免疫亲和柱，当样液通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素与抗体发生特异性反应而被截留，与杂质分离，然后用适当的溶剂洗脱黄曲霉毒素进行检测。这种亲和色谱柱的净化和浓缩效果好，特异性高。

4. 固相微萃取法(solid phase micro-extraction, SPME)是在固相萃取技术的基础上发展起来的新型样品前处理技术。根据相似者相溶的原理，利用石英纤维表面涂渍的固定相对待测组分的吸附作用，使试样中的待测组分被萃取和浓缩，然后利用气相色谱进样口的高温、高效液相色谱或毛细管电泳的流动相将萃取的组分从固相涂层上解吸下来进行分析的一种样品前处理方法。目前最常用的涂层是聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酸酯(PA)。与传统的分离富集方法相比，固相微萃取法具有无需溶剂、操作简单、效率高、选择性好、成本低等优点。SPME可与GC HPLC或CE等仪器联用，使样品萃取、富集和进样合而为一，从而大大提高了样品前处理的速度和方法的灵敏度(图3-6)。

图3-6 固相微萃取装置

1.推进杆；2.手柄筒；3.Z型支点；4.支撑推杆旋钮；5.透视窗；6.针深度调节；
7.穿刺隔垫针筒；8.萃取头套管；9.萃取头

固相微萃取装置类似于微量注射器，由手柄和萃取头两部分构成。萃取头是一根涂有不同色谱固定液或吸附剂的熔融石英纤维，通常长为0.5～1.5cm、直径为0.05～1mm。将其接在不锈钢针上，外面套有不锈钢管，用以保护石英纤维不被折断。石英纤维头可在针管内伸缩，需要时可推动手柄使石英纤维从针管内伸出。分析时先将试样放入带隔膜塞的固相微萃取专用容器中，可以在试样瓶中加入无机盐、衍生剂或调节试样的pH，还可进行加热或磁力搅拌，然后再进行萃取。固相微萃取通常分为两步，第一步是吸附，将针头插入试样容器中，推出石英纤维，通过其表面的高分子固相涂层，对样品中有机分子进行萃取和预富集，并将石英纤维收回不锈钢针管内；第二步是解吸，将针头插入色谱进样器中，再推出石英纤维完成热解吸或溶剂解吸，然后进行色谱分析。固相微萃取的方式有两种：一种是石英纤维直接插入试样中进行萃取，适用于气体与液体中组分的分离；另一种是顶空萃取，适用于各种基体样品中挥发性、半挥发性组分的分离。影响SPME萃取效果的主要因素有萃取头涂层的种类、萃取时间、萃取温度、搅拌速度、pH和盐浓度等。其中涂层的种类、厚度对待测物的萃取量和平衡时间有重要的影响。

5.凝胶渗透色谱(gel-permeation chromatography, GPC)又称体积排阻色谱，是根据多孔性凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离的色谱技术。选择不同孔径的多孔凝胶作为固定相，流动相带动样液在柱内移动，大分子不能渗透到凝胶空穴内部而被排阻，因而被较早地洗脱下来，由于小分子可以渗透到凝胶空穴内部而较晚流出，从而使相对分子量不同的物质达到分离。目前，凝胶渗透色谱法已经成为农药残留分析中一种常用、有效的净化方法。农药的分子量一般小于500，而样品中的色素、油脂、生物碱、聚合物等大分子杂质，先于农药分子被洗脱出来，从而实现分离。凝胶渗透色谱法具有净化容量大、净化效果好、柱子可以重复使用、自动化程度高等优点，可以同时实现样品的净化和浓缩，尤其适用于净化含脂类、色素等大分子杂质的复杂基体。

6．磺化法(sulfonation)脂肪与浓硫酸发生磺化反应，在分子末端引入磺酸基团，生成极性较大且易溶于水的化合物。利用这一反应，使脂肪分子由有机溶剂转入浓硫酸中，再用水洗除去。浓硫酸也可对色素等杂质中的不饱和键起加成作用。由于极性增大，其不再被弱极性的有机溶剂所溶解，从而达到净化的目的。磺化法主要用于对酸稳定的待测成分的净化，以除去样品中的脂肪、色素等干扰，如测定食品中有机氯农药(DDT和六六六等)；待测组分对酸不稳定时不能采用，如狄氏剂和一般有机磷农药，但个别有机磷农药也可在控制一定酸度的条件下应用。

7. 皂化法(saponification)利用脂肪与碱发生反应，生成易溶于水的羧酸盐和醇，从而除去样品提取液中的脂肪，可用于某些对碱稳定的待测成分净化。例如，食品中维生素A和苯并[a]芘对碱稳定，样品可以直接进行皂化处理，除去脂肪。有些成分如维生素E虽然对碱不稳定，但在抗氧化剂(如坏血酸)存在下也可用皂化法除去样品中的脂肪。

8.凝固法当待测组分与大量脂肪共存时，将样品以丙酮提取后，再在-15℃使脂肪凝固，从而使大部分脂肪除去。例如，油样中棉酚的测定，用70％丙酮振荡提取后，在冰箱中放置过夜，除去脂肪，取上清液过滤后测定。

相关链接：食品样品待测成分提取（三）

文章来源：《食品理化检验》

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