(三)其他B族维生素测定

1．维生素B₃维生素B₃又称烟酸(nicotinamide)、尼克酸(niacin)、维生素PP。是指具有烟酸生物学活性的吡啶-3-羧酸及其衍生物的总称，包括烟酸和烟酰胺。为白色针状结晶，在酸、碱、光、氧或加热条件下不易被破坏，是维生素中最稳定的一种。烟酸的测定方法有高效液相色谱法(GB 5413.15)、分光光度法(GB/T 9695.25)、微生物法(GB/T 5009.89)等。高效液相色谱法是将试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后，以C₁₈色谱柱分离烟酸和烟酸胺，用紫外检测器于261 nm波长处测定吸光度值，标准曲线法定量。此法适用于婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定。分光光度法的测定原理是：烟酸经氢氧化钙溶液提取，与溴化氢结合，在对氨基苯乙酮作用下，生成黄色化合物，在420nm波长处测定吸光度值，标准曲线法定量。此方法适用于肉与肉制品中烟酸的检测。

2．维生素B₆ 吡哆醇(pyridoxine, PN)、吡哆醛(pyridoxal,PL)、吡哆胺(pyridoxamine,PM)是维生素B₆的3种天然存在形式，它们易溶于水，在空气和酸性环境中稳定，碱性条件和光照下易被破坏。

维生素B₆的测定方法有荧光分光光度法、微生物法(GB/T 5009.154)、高效液相色谱法(GB 5413.13)。高效液相色谱法原理是：试样经热水提取、净化后，经C₁₈色谱柱分离，荧光检测器检测，标准曲线法定量。适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B₆的测定。

3．维生素B₁₂又称钴胺素(cobalamin)，呈现钴元素的深红色，易溶于水和乙醇，在强酸、强碱、光照条件下及氧化剂存在下易被破坏。常用于测定维生素B₁₂的方法有高效液相色谱法、离子交换色谱法、原子吸收分光光度法等。食品安全国家标准中婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的测定采用微生物法(GB 5413.14)；保健食品中维生素B₁₂的测定方法采用高效液相色谱法(GBIT 5009.217)，利用固相萃取或免疫亲和色谱法对样品提取液中的维生素B₁₂进行富集并去除杂质后，用高效液相-紫外检测器进行测定。

4. B族维生素同时测定针对单个维生素的测定方法较为费时，而采用高效液相色谱法可以同时检测多种B族维生素。我国国家标准方法采用高效液相色谱法对保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸和烟酰胺同时进行检测(GBIT 5009.197)。

样品经甲醇、水和磷酸的混合液((100+400+0.5)超声波提取，离心、过滤后，以C₁₈柱分离，紫外检测器检测，标准曲线法定量。在流动相中加入0.1%磷酸调节pH可以降低B族维生素的离子化，从而调节其保留时间和分离度，改善峰形。另外，流动相中加入烷基磺酸盐，可与离解的B族维生素生成中性离子对，利于分离检测。为提高检测灵敏度，维生素B₁检测波长可调节为260nm，维生素B₆、烟酸和烟酰胺的波长可调节为280nm。

(四)维生素C测定

维生素C即抗坏血酸(ascorbic acid)，为无色结晶，对光、热敏感，在碱性条件下易被氧化，酸性条件下较为稳定，其有较强还原性。抗坏血酸被氧化的产物脱氢抗坏血酸仍具有生理活性，但进一步氧化则生成无生理活性的2,3-二酮古乐糖酸。食品分析中测定的总抗坏血酸仅包括前两者，即抗坏血酸和脱氢抗坏血酸。

抗坏血酸的测定方法有荧光分光光度法、分光光度法、滴定法、高效液相色谱法等。其中荧光分光光度法由于灵敏度高、干扰较小、操作简便等优点被广泛采用(GBIT 5009.86;GBIT 9695.29; GB 5413.18); 2,6-二氯靛酚滴定法(GB 6195)和固蓝盐比色法(GBIT5009.159)用于测定食品中还原型抗坏血酸含量，荧光分光光度法和2,4-二硝基苯肼法测定的是食品中总抗坏血酸含量。

1．总抗坏血酸的测定

(1)荧光法

1)原理：还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸后，可与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹喔啉(quinoxaline )，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，由此可测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。样品中荧光杂质的干扰可通过脱氢抗坏血酸与硼酸形成复合物而不能与OPDA反应生成荧光物质排除。

2)分析步骤：称取适量样品，加入偏磷酸-乙酸溶液，匀浆，调节pH至1.2并过滤；分别取样品滤液和标准溶液，加入活性炭生成样品氧化液和标准氧化液，过滤；取上述两种滤液分别加入硼酸-乙酸钠溶液，4℃冰箱中放置2小时作为空白溶液；再分别另取样品氧化液和标准氧化液各一份，加入乙酸钠溶液，备用。

取样品空白和样品液，在暗室中迅速加入邻苯二胺，振摇混合，于室温下反应35分钟，用激发光波长338nm，发射光波长420nm测定荧光强度。同样方法测定标准空白液和标准系列的抗坏血酸溶液的荧光强度，用抗坏血酸含量为横坐标，对应标准溶液的荧光强度减去标准空白荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线并计算样品中抗坏血酸的含量。

3)方法说明：①本方法最低检出量为0.022ug/ml，线性范围5～20ug/ml。本操作应全程避光；②邻苯二胺溶液因在空气中颜色逐渐加深，影响显色，故需临用前配制；③活性炭用量要准确，因其氧化作用是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入不足，氧化不充分；加入过量，对抗坏血酸有吸附作用；④影响荧光强度的因素很多，为保证测定条件一致，标准曲线最好与样品平行测定。

(2)2,4-二硝基苯肼法

1)原理：样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化后生成脱氢抗坏血酸，再与2,4-二硝基苯肼作用，生成红色脎，其颜色强度与总抗坏血酸含量成正比，通过测定吸光度定量。

2)分析步骤：取适量样品，加入草酸匀浆，定容，过滤。取一定体积滤液加入活性炭氧化，再加入硫脲混匀。取3支试管分别加入上述氧化液，1支作为空白，另2支加入2,4-二硝基苯肼37℃保持3小时显色，取出后冰水冷却，空白管冷至室温后同样加入2,4-二硝基苯肼。向每支试管再滴加85％硫酸脱水，室温放置30分钟后立即于波长500nm处测定吸光度值。

3)方法说明：①本方法最低检出量为0.1ug/ml，线性范围1～12ug/ml;②实验过程应该避光进行；③加入硫脲可防止抗坏血酸氧化，并利于脎的形成，但硫脲在溶液中最终浓度应一致，否则影响测定；④冰水中取出30分钟后立即测定，否则溶液颜色加深。

2．还原型抗坏血酸测定

(1)原理：2,6-二氯靛酚染料在中性或碱性条件下呈蓝色，在酸性溶液中呈粉红色，被还原后颜色消失。滴定时，还原型抗坏血酸将染料还原为无色，本身被氧化为脱氢抗坏血酸，终点时，稍过量的染料使溶液呈微红色。

(2)分析步骤：样品中抗坏血酸用偏磷酸-乙酸提取，过滤,2,6-二氯靛酚染料现配制并用已知浓度抗坏血酸标准溶液标定。用染料将样品滤液滴定至颜色变为微红色15秒不消失为终点。同时做空白，根据染料消耗的体积，计算样品中抗坏血酸的含量。

文章来源：《食品理化检验》

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