拉曼光谱可提供样品分子中存在的官能团的结构信息，可用于鉴别试验和结构解析；同时，拉曼光谱与红外光谱一样，其吸收峰也存在加和性，符合比尔定律，可用于物质的定量，且由于其对水的响应较低，可直接用于水溶液的测定。

一、定性鉴别

在相同的测定条件下，绘制供试品与对照品的拉曼光谱并进行比对，若相同，除立体异构体外，即可鉴别为同一化合物。如遇多晶型现象，可参照红外鉴别的相关内容进行处理。

二、定量测定

拉曼谱带的强度与待测物浓度的关系遵守比尔定律：

I_v=KLCI₀                     (式21-1)

式中，I_v为给定波数处的峰强；K为仪器和样品的参数；L为光路长度；C为样品中特定组分的摩尔浓度；I₀为激光强度。

实际工作中，光路长度被更准确地描述为样品体积，这是一种描述激光聚焦和采集光学的仪器变量。上述等式是拉曼光谱用于定量的基础。

激光拉曼光谱定量测定的一般步骤如下：

1．由拉曼光谱鉴定样品的组分。

2．选择适当强度的分析谱带，该谱带不与样品的其他谱带重叠。

3．选择内标，内标的谱带与分析谱带邻近，但不重叠。

4．配制近似于样品的一组标准样品，标准样品和被测样品中都加入一定量的内标物。

5．在相同的条件下测定一组标准样品和被测样品中分析谱带与内标谱带的强度比(通常比较拉曼峰的高度或面积)。

6．绘制C_s/C_I-I_s/I_I工作曲线，C_s和C_I是标准样品中被测组分和内标物的浓度或重量，I_s和I_I是标准样品中分析谱带和内标谱带的强度。

7．测定被测样品的I_S/I_I，由工作曲线可求出被测物的浓度和含量。

《美国药典》38版采用Raman光谱法测定盐酸林可霉素胶囊的溶出度。溶出度方法为转篮法，溶出介质为500ml水，转速为100r/min, 45分钟溶出量的限度(Q)值为75%测定法为取溶出续滤液20ml，精密量取5 ml，置一小试管中，精密加入内标溶液(0.01mol/L硫酸钠溶液)250ul，真空离心干燥至干，用10.0ul水溶解所有固体，以毛细管取样，置Raman光谱仪中测定，量取720～660cm^-1处的Raman光强度(基线校正)，结果除以994～966cm^-1处的Raman光强度；同法测定相同浓度的USP盐酸林可霉素对照品溶液，计算，即得。

三、影响定量测定的因素

最主要的干扰因素是荧光、样品的热效应和基质或样品自身的吸收。在拉曼光谱中，荧光干扰表现为一个典型的倾斜宽背景。因此，荧光对定量的影响主要为基线的偏离和信噪比的下降，荧光的波长和强度取决于荧光物质的种类和浓度。与拉曼散射相比，荧光通常是一种量子效率更高的过程，甚至很少量不纯物质的荧光也可以导致显著的拉曼信号降低。使用更长的波长例如785或1064nm的激发光可使荧光显著减弱。然而，拉曼信号的强度与λ^-4成比例，λ是激发波长。通过平衡荧光干扰、信号强度和检测器响应可获得最佳的信噪比。

测量前将样品用激光照射一定时间，固态物质的荧光也可得以减弱。这个过程被称为光致漂白，是通过降解高吸收物质来实现的。光致漂白作用在液体中并不明显，可能是由于液体样品的流动性或荧光物质不是痕量。

样品加热会造成一系列的问题，例如物理状态的改变(熔化)、晶型的转变或样品的烧灼，这是有色的、具强吸收或低热传导的小颗粒物质常出现的问题。样品加热的影响通常是可观察的，表现在一定时间内拉曼光谱或样品的表观变化。除了减少激光通量，有许多种方法可用来降低热效应，例如在测量过程中移动样品或激光。

基质或样品本身也可吸收拉曼信号。在长波傅里叶变换拉曼系统中，拉曼信号可以与近红外的泛频吸收重叠。这种影响与系统的光学以及样品的形态有关。样品的装填和颗粒大小的差异而引起的固体散射的可变性与这种效应有关。然而，由于在拉曼光谱中样品的有限穿透深度和相对狭窄的波长范围，所有这些效应的大小都没有近红外光谱严重。

定量拉曼光谱与许多其他的光谱技术不同，它是单光束零背景测量。谨慎地进行样品测定以及使用设计合理的仪器可以使这种变异减到最小，但是并不能全部消除。所以，绝对的拉曼信号很难直接用于待测物的定量。变异的潜在来源是样品的不透明性和样品的不均匀性、照射样品的激光功率的变化以及光学几何学或样品位置的变化，这些影响可以通过重复的或有代表性的样品处置方式予以减小。

由于拉曼信号绝对强度的波动，应尽可能地使用内标。可以有目的地加入一种内标，该内标应具有与待测物互不干扰的独特谱带以便于检测。在溶液中，也可利用溶剂的独特谱带，不会因为样品的改变而变化。另外，在制剂中，如果赋形剂的量大大超过待测组分，则可以使用该赋形剂的峰。在假设激光和样品定位的改变将会同等地影响全光谱的前提下，全光谱同样可以用作参比。

样品测定中需要考虑的重要因素还有光谱的污染。拉曼是一种可以被许多外源影响掩蔽的弱效应。普通的污染源包括样品支持物(容器或基质)和周围光线。通常，这些问题可以通过细致的试验方法来识别和解决。

相关链接：拉曼光谱仪的组成

文章来源：《实用化学药品检验检测技术指南》

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