7 测定步骤

7.1 提取

准确移取2.0 mL牛尿，置于5 mL具塞离心管中，加入2 mL乙酸钠缓冲液(4.14)、20uL β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶(4.1)、100uL内标溶液(4.22)于每个样品中，混匀，于37℃过夜。

7.2 净化

将提取液(7.1)移入下接Oasis HLB柱(4.18)的贮液器中，溶液以≤1 mL/min的流速通过Oasis HLB柱，待溶液完全流出后，用甲醇＋水(4.12)洗柱，弃去全部淋出液。最后用6 mL甲醇+四丁基甲醚(4.13)洗脱，收集洗脱液于10 mL具塞离心管(5.2)中，用氮气浓缩仪(5.6)吹至约剩余500uL溶液。加入2×2 mL异辛烷于上述10 mL离心管中提取两次，以2000r/min离心5 min。取上层液体于5 mL具塞离心管(5.2)，于40℃下氮气吹干。

7.3 衍生化

在上述5 mL具塞试管中依次加入85 uL干燥乙酸乙酯(4.15), 500 uL乙酸乙酯+吡啶(4.16),20 uL五氟苯甲酰氯(4.8)，混匀，于60℃放置20 min后，用氮气浓缩仪吹干。加入500 uL 0.5 mol/LKHCO₃溶液(4.17),涡旋振荡，待溶液澄清后，准确加入0.4 mL异辛烷，混合提取，静置，取上清液进行测定。

7.4 测定

7.4.1 气相色谱-质谱测定条件

a)色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 um)石英毛细管柱或相当者；

b)载气：氦气，纯度≥99.999％；

c)流速：初始流速1.0 mL/min，保持5 min，然后以1.0 mL/min速度升至3 mL/min;

d)柱温;120℃保持2 min，然后以15℃/min程序升温至250℃，再以5℃/min升温至300℃保持8 min；

e)进样量：1 uL;

f)进样方式：无分流进样；

g)进样口温度：300℃;

h)接口温度：280℃;

i)负化学源：150eV;

J)离子源温度：150℃；

k)四极杆温度：106℃;

1)反应气：甲烷，纯度≥99.99％；

m)反应气流量：2 mL/min。

n)选择离子监测，见表1。

表1 选择离子监测表

7.4.2 定性测定

定性测定的依据为：

a)被测样品色谱峰的保留时间与标准工作溶液相一致；

b)所选择的离子均出现，被测样品的监测离子的相对丰度与标准工作溶液的相对丰度两者之差不大于允许相对偏差(7.4.1)。

7.4.3 定量测定

配制系列标准工作溶液(4.23)分别进样，仪器测定β-雌二醇以m/z 660为定量离子，内标β-雌二醇D4以m/z 664为定量离子，以峰面积比对浓度绘制标准工作曲线，用标准工作曲线内标法对样品进行定量，样品溶液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，雌二醇衍生物参考保留时间约为26 min。

7.5 平行试验

以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.6 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行。

8 结果计算

结果按式(1)计算

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为微克每升(ug/L);

c—从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液定容体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

注：计算结果应扣除空白值。

9 精密度

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.1 重复性

在重复性条件下,牛尿中雌二醇的含量在0.25 ug/L～2.0 ug/L范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，本标准的重复性限按式(2)计算：

r=0.155m～0.0101······(2)

式中：

m—雌二醇测定值的浓度，单位为微克每升(ug/L)。

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2 再现性

在再现性条件下，牛尿中雌二醇的含量在0.25 ug/L～2.0ug/L范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，本标准的再现性限按式(3)计算：

1gR＝1.1021gm-0.885······(3)

式中：

m—雌二醇测定值的浓度，单位为微克每升。

相关链接：气相色谱-负化学电离质谱法测定牛尿中β-雌二醇残留量（一）

文章来源：《化学试剂标准汇编》

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