7 测定步骤

7.1 提取

称取5g试样(精确至0.01g)于50 mL聚丙烯离心管中，加入10g无水硫酸钠，0.1g焦性没食子酸，加乙腈2×20 mL，均质提取1 min。以3000r/min离心3 min。合并提取液于另一个50 mL聚丙烯离心管中。待净化。

7.2 净化

在乙腈提取液中加入20 mL乙腈饱和的正己烷(4.3) ,涡旋混匀后振荡3 min，以2000r/min离心2 min，弃去上层正己烷，取下层乙腈20 mL，旋转蒸发近干，用5 mL乙腈定容，过0.2um滤膜，待测定。

7.3 测定条件

7.3.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：BEH C₁₈,1.7 um，50 mm×2.1 mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙腈+0.1％甲酸溶液(97+3) ;

c)流速：0.30 mL/min;

d)柱温：30℃；

e)进样量：5.0uL;

f)检测波长：470 nm。

7.3.2 色谱测定

根据试样中被测物质的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中角黄素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，角黄素反、顺式异构体的保留时间分别为1.10 min和1.26 min。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并用外标法定量。

7.4 确证

7.4.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：BEH C₁₈,1.7um，50 mm×2.1 mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙腈(4.2)+0.1％甲酸(4.8)(97+3)；

c)流速：0.40 mL/min;

d)柱温：35℃：

e)进样量：5.0 uL。

7.4.2 质谱参考条件

a)离子源：电喷雾源ESI，正离子模式(ESI+) ;

b)扫描方式：多反应监测(MRM)；

c)毛细管电压：3.5kV;

d)锥孔电压：38V;

e)离子源温度：120℃；

f)去溶剂气温度：400℃；

g)去溶剂气(氮气)流量：800L/h;

h)锥孔气(氮气)流量(N₂):50L/h;

i)碰撞能量：20V;

j)碰撞气流量：0.1L/h;

k)检测离子对：定量：565.5/203.1；定性：565.5/203.1、565.5/133.1。

7.4.3 液相色谱-串联质谱确证

将各被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差±2.5％之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。

表1 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.5 平行试验

按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。

7.6 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行测定。

8 结果计算

角黄素残留量的测定结果按式(1)计算。

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ug/kg)。

C—从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液定容体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

计算结果应扣除空白值。

9精密度

9.1 一般规定

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2规定确定的，其重复性和再现性的值是以95％的可信度来计算。

9.2 重复性

在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中角黄素添加浓度范围及重复性方程见表2。

表2 角黄素添加浓度及重复性和再现性方程单位为毫克每千克

如果两次见定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.3 再现性

在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中角黄素添加浓度范围及再理性方程见表2。

相关链接：河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素残留量的测定（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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