7 分析步骤

7.1 提取

称取2g试样，精确到0.01g，置于25 mL具塞离心管中，加入4 mL水和4 mL乙酸乙酯(4.2)，在液体混匀器上充分混匀2 min，使试样完全溶解。在振荡器上振荡10 min，以4000r/min离心10 min,准确吸取上层乙酸乙酯1 mL于10 mL具塞试管(5.7)中，用氮气吹干仪在50℃吹干。加入0.5mL缓冲溶液(4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。此溶液含试样量0.5g，稀释系数为1。

7.2 测定条件

以下所有操作应在20℃～24℃室温下进行。

7.2.1 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。

7.2.2 洗板条件如下：

7.2.2.1 洗板机洗板条件：采用条式抽干和注满，洗涤次数八次，每次注水量为250uL～350uL。

7.2.2.2 入工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250 uL。

7.2.3 氯霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可使用。氯霉素标准溶液(4.1.2),氯霉素酶标记物溶液(4.1.3)和氯霉素抗体溶液(4.1.4)等均按1份试剂＋10份缓冲溶液进行稀释与制备。每次测定所用的稀释液均应现配现用。

7.2.4 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。

7.3 测定

测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

7.3.l 分别吸取50uL稀释的酶标记物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体等按模板图位置，依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育2h。

7.3.2 将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。此步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔干燥。

7.3.3 迅速加入50uL酶基质和50uL发色剂于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育30min。

7.3.4 迅速加入100uL反应停止液于微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450 nm处测量吸光度(加入反应停止液后应在60 min内读取吸光度)。

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一标准、同一样品溶液均应进行平行试验测定。

7.5 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行。

7.6 监控试验

每次测定均应做一个添加氯霉素标准的样品。

8 结果计算

在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标(％)，氯霉素标准溶液浓度(ug/kg)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的氯霉素浓度后，结果按式(1)计算：

式中：

X—试样中氯霉素残留量，单位为微克每千克(ug/kg);

c—从标准工作曲线上得到的试样中氯霉素浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克(g)。

结果表示到小数点后两位。

注：计算结果应扣除空白值。

9 确证试验

如被测样品中氯霉素残留量的值大于检出限时，应用GC-MS法或LC-MS-MS法进行确证。

10 精密度

本部分的精密度数据是按照GB/T 6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95％的可信度来计算。

10.1 重复性

在重复性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.300ug/kg～4.050ug/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，本部分的重复性限按方程式(2)计算：

r=0.0497m＋6.6495······(2)

式中：

m—两次测定值的平均值，单位为微克每千克(ug/kg)。

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

10.2 再现性

在再现性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.300ug/kg～0.50ug/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性(R)，本部分的再现性限按方程式(3)计算：

1gR＝0.9572 lgm-0.8374······(3)

式中：

m—两次测定值的平均值，单位为微克每千克(ug/kg)。

相关链接：酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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