酶免疫分析法是20世纪60年代发展起来的一种新的免疫测定法，是以酶标记的抗体或抗原为主妻试剂的方法，是标记免疫技术的一种。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者主要测定可溶性抗原或抗体。现在ELISA是食品安全检测中最常用的酶免疫技术之一。

一、基本原理

酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，El—ISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic technique)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其基本原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，并保持其免疫活性，加入酶标抗体或抗原，这种酶标抗体或抗原既保留其免疫活性，又保留酶的活性，燮时，使受检标本和酶标抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物，通过洗涤，洗去游离的酶标抗体或抗原，而形成的酶标免疫复合物不能被洗去，当加入酶的底物时，底物被酶催化生成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色的深浅对标本中的抗原或抗体进行定性和定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)等。

二、ELISA的种类

ELISA常用的方法包括直接酶联免疫吸附法、间接酶联免疫吸附法、双抗体夹心酶联免疫吸附法和竞争酶联免疫吸附法。

①直接酶联免疫吸附法(direct ELISA)是指酶标抗原或抗体直接与吸附在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原一抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出吸附在酶标板上的抗体或抗原的量。A将待测抗原吸附在载体表面；B加入酶标抗体，形成抗原一抗体复合物；℃加酶的底物，产物的生成量与抗原量呈正相关。

②间接酶联免疫吸附法(indirect EI。ISA)是检测抗体最常用的方法，其原理是将特异性抗原与固相载体结合，形成固相抗原，加入受检标本，标本中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原一抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，加入酶标抗抗体，它与固相复合物上的抗体相结合，从而使该抗体间接地标记上酶，洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量，因此加入底物显色，颜色深度就代表受检标本中抗体的量。A将抗原吸附于固相载体表面；B加待测抗体，形成抗原一抗体复合物；C加酶标抗抗体；D加底物，产物的生成量与抗体量呈正相关。

③双抗体夹心酶联免疫吸附法(double antibody sandwich，DAS—ELISA)是将特异性抗体吸附到固相载体上，加入含有待测抗原的样品，使抗原与固相载体上特异性抗体反应，洗涤除去未反应的样品，加入酶标记的特异性抗体与抗原反应，最后加入底物显色。本法只适用于较大分子抗原的分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。A将已知特异性抗体吸附于固相表面；B加入待测抗原，形成抗原一抗体复合物；C加酶标记的特异性抗体与抗原反应形成抗体一抗原一抗体复合物；D加入底物显色，产物的生成量与抗原量呈正相关。

④竞争酶联免疫吸附法(competing ELISA)可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗体为例，受检抗体与酶标记抗体竞争与固相抗原结合，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量成反比。A1、A2、A3将抗体吸附在固相载体表面；B1加入酶标记的抗原；Bz、Bs加入酶标记的抗原和待测抗原;加底物，样品孔产物生成量与待测抗原量呈负相关。

三、最适工作浓度的选择

在建立某一ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的最佳工作浓度进行研究，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。常用方阵(棋盘)法分别进行实验，选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，确定最佳的测定条件。研究及测定中都必须设置强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)。