(3)苏丹红检测方法

苏丹红具有良好的化学稳定性，并且化学结构中具有发色团，具有特定的吸收波长，因此针对苏丹红检测开发的方法多为仪器方法。目前，食品中苏丹红的检测方法主要有采用高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、薄层层析法、极谱法、毛细管电泳、分光光度法等。上述检测方法相对成熟，并且检测结果准确，国家标准GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法-高效液相色谱法》采用仪器方法进行检测，标准内容如下：

①范围。本标准适用于食品中苏丹红染料的检测。

本标准规定了食品中苏丹红1、苏丹红2、苏丹红3、苏丹红4的高效液相色谱测定方法。方法最低检测限：苏丹红1、苏丹红2、苏丹红3、苏丹红4均为10ug/kg。

②术语和定义。苏丹红：属偶氮系列化工合成染料。

③方法要点。样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱-紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。

④试剂与标准品。

a. 乙腈色谱纯。

b．丙酮色谱纯、分析纯。

c．甲酸分析纯。

d．乙醚分析纯。

e. 正己烷分析纯。

f. 无水硫酸钠分析纯。

g．层析柱管：1cm(内径)×5cm(高)的注射器管。

h．层析用氧化铝(中性100～200目)：105℃干燥2h，于干燥器中冷至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。

注：不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1ug/mL的苏丹红的混合标准溶液1mL加到柱中，用5％丙酮正己烷溶液60mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红2、苏丹红4、苏丹红1、苏丹红3，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红2、苏丹红4的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红3的回收率偏低时表明活性偏高。

i．氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3 cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。

j. 5％丙酮的正己烷液：吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。

k．标准物质：苏丹红1、苏丹红2、苏丹红3、苏丹红4；纯度≥95％。

l．标准贮备液：分别称取苏丹红1、苏丹红2、苏丹红3及苏丹红4各10.0mg(按实际含量折算)，用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。

⑤仪器与设备。

a．高效液相色谱仪(配有紫外可见光检测器)。

b．分析天平：感量0.1mg。

c. 旋转蒸发仪。

d．均质机。

e. 离心机。

f. 0.45um有机滤膜。

⑥样品制备。将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。

⑦操作方法。

a．样品处理。

红辣椒粉等粉状样品：称取1～5g(准确至0.001g)样品于三角瓶中，加入10～30mL正己烷，超声5 min，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5％丙酮的正己烷液60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45um有机滤膜过滤后待测。

红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品：称取0.5～2g(准确至0.001g)样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解(约1～10mL)，难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。按红辣椒粉中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。

辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品：称取10～20g(准确至0.01g)样品于离心管中，加10～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮=3:1，匀浆5min, 3000r/miry离心10min，吸出正己烷层，于下层再加入20mL×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5min，用5mL正己烷溶解残渣后，按红辣椒粉中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。

香肠等肉制品：称取粉碎样品10～20g(准确至0.01g)于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min,滤出清液，再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按红辣椒粉中“慢慢加入到氧化铝层析柱中……过滤后待测”操作。

b．推荐色谱条件。

仪器条件：色谱柱：Zorbax SB-C₁₈ 3.5um 4.6mm×150mm(或相当型号色谱柱)；流动相：溶剂A0.1％甲酸的水溶液，乙腈=85：15、溶剂B0.1％甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20。梯度洗脱：流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：苏丹红1478nm；苏丹红2、苏丹红3、苏丹红4520nm；于苏丹红1出峰后切换。进样量10uL。梯度条件见表8-9。

表8-9 梯度条件

吸取标准储备液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为。ug/mL、0.16ug/mL, 0.32ug/mL、0.64ug/mL、1.28ug/mL、2.56ug/mL，绘制标准曲线。

c．计算。

按公式(8-1)计算苏丹红含量：

R＝C×V/M                (8-1)

式中R—样品中苏丹红含量，mg/kg;

C—由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，ug/mL;

V—样液定容体积，mL;

M—样品质量，g。

相关链接：苏丹红物理化学性质及毒理学危害（一）

文章来源：《食品安全中的化学危害物》

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