3.4 测定步骤

3.4.1 提取和净化

称取试样5.0g(精确至0.1g)，置于均质器中，加入无水硫酸钠10 g及三氯甲烷-甲醇(2+1)混合液100 mL，均质1 min, 3000r/min离心10 min后，将提取液转入500 mL分液漏斗中。于残留物中再加三氯甲烷-甲醇(2+1)混合液75 mL，同样操作。合并提取液。加入缓冲液(pH3) 50 mL，振摇5 min。静置分层，取下层。于上层中加入三氯甲烷40 mL，同样操作。合并下层溶液。用旋转蒸发器浓缩至干。将残留物用乙腈10 mL及正己烷50 mL移入预先加入200氯化钠溶液100 mL的500 mL的分液漏斗中，振摇10 min，静置分层，取下层置于另一分液漏斗中。于上层中再加入乙腈10 mL，振摇5 min后，静置分层。合并下层溶液，再振摇5 min，静置分层，弃去上层溶液。于下层溶液中加入二氯甲烷50 mL，振摇10 min。静置分层，取下层二氯甲烷。上层再用二氯甲烷50 mL作同样操作。合并二氯甲烷层并使其全部通过装有5g无水硫酸钠柱，滤入蒸馏瓶中，用旋转蒸发器将二氯甲烷层浓缩至干。加入甲醇-水-乙腈(4+5+2)1.0 mL以溶解残留物，供测定。

3.4.2测定

3.4.2. 1色谱条件

a．色谱柱：250 mm×3.9 mm(内径)，u Bondapak C₁₈，10 um粒度；

b．流动相：甲醇-柠檬酸(0.1 mol/L)-乙腈(4+5+2)(含0.025％十二烷基磺酸钠)：

c．流速：1 mL/min;

d．检定波长：280nm。

3.4.2.2 色谱测定

分别将等体积标准工作液、样液注入液相色谱仪，测量峰面积(或峰高)。

吡咯嘧啶酸响应值应在仪器测定线性范围内。吡咯嘧啶酸保留时间约10 min。

3.4.3 空白试验

除不称取样品外，按上述测定步骤进行。

3.5 结果计算和表述

按下式计算试样中吡咯嘧啶酸的含量：

式中：X—试样中吡咯嘧啶酸含量，mg/kg；

A—样液中吡咯嘧啶酸色谱峰面积(或峰高)，mm2(或mm) ;

A_s—标准工作溶液中吡咯嘧啶酸色谱峰面积(或峰高)，mm2(或mm) ;

c—标准工作溶液中吡咯嘧啶酸的浓度，ug/mL；

V—样液最后定容体积，mL;

m—试样量，g。

注：计算结果需扣除空白值。

4 测定低限、回收率

4.1 测定低限

本方法测定低限为0.05mg/kg。

4.2 回收率

回收率的实验数据：吡咯嘧啶酸添加浓度在0.05～0.4 mg/kg范围内，回收率为76.7％～89.7％。

注：考虑到柠檬酸对色谱柱的使用寿命有影响，也可用0.5mol/L的H₃PO₄溶液调节pH到4的甲醇-水-乙腈(25+55+20)作流动相。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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