4.4 测定步骤

4.4.1 提取和净化

准确称取已捣碎的样品5.00g于50 mL离心管中，先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂1(液体20.0 mL)，用匀浆机以8000r/min的速度均质30 s，再加入提取剂2(固体粉末)，振荡1 min, 4000r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于鸡心瓶中再加入异丙醇10 mL，50℃～55℃水浴旋转蒸干。残留物用2.5 mL流动相溶解，溶解液放入2.5mL离心管中，8 000 r/min离心5 min后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。

4.4.2 绘制标准工作曲线

移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫混合标准溶液，用流动相稀释成0.1ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL标准工作溶液，用高效液相色谱-串联质谱仪测定，得出标准工作曲线。

4.4.3 测定

4.4.3.1 高效液相色谱-串联质谱条件

a)色谱柱：C₁₈柱，150 mm火2.1 mm(内径)，粒度5 um;

b)流动相：乙腈＋5 mmol/L乙酸铵(75×25,V/V);

c)流速：0.2 mL/min；

d)柱温：35℃；

e)进样量：10 uL ;

f)离子源：电喷雾ESI，正离子；

g)扫描方式：多反应监测MRM ;

h)雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到要求；

i)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；

j)监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313定量离子)、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316(定量离子)、331/239；结晶紫m/z 372/356(定量离子)、372/251；隐色结晶紫m/z 374/358(定量离子)、374/238。

4.4.3.2 液相色谱-串联质谱定量测定

按照4.4.3.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，标准曲线法测定样液中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量。样品中被测物残留量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应用流动相适当稀释。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫的保留时间约为1.89 min、5.35 min、2.47 min和5.51 min。

4.4.3.3 液相色谱-串联质谱定性测定

按照4.4.3.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中两对离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25％时方可确定两者为同一物质。

4.5 空白试验

除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

4.6 结果计算表述

按式(2)分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量，计算结果需扣除空白。

式中：

w—水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫残留量，单位为微克每千克(ug/kg);

ci—标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的标准工作溶液浓度，单位为微克每升(ug/L);

V—最终定容体积数，单位为毫升(mL);

2—换算常数；

m—供试试料样品质量，单位为克(g)。

本方法分别计算孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿，并分别报告孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿结果。

本方法分别计算结晶紫及代谢物隐色结晶紫，并分别报告结晶紫及代谢物隐色结晶紫结果。

5 测定低限、回收率

5.1 测定低限

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测低限均为0.5ug/kg。

5.2.1 回收率

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率均为：85％～105％。

相关链接：水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法(二）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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