7 测定步骤

7.1 提取

称取5g均匀样品(精确到0.01g)于100 mL离心管中，加入5g中性氧化铝，再依次加入1.0mL对甲苯磺酸(5.9)溶液、4.0 mL乙酸钠缓冲溶液(5.8)涡旋30 s。加入8 mL乙腈,10000r/min均质2 min，离心5 min(2000 r/min)，将上清液转移到50 mL离心管中，用4.0mL乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于离心管中加入8 mL 二甘醇溶液(5.7), 10 mL二氯甲烷，涡旋1 min，离心5 min(2000 r/min)，收集下层有机层于浓缩瓶中，在40℃减压旋转蒸发至干。

7.2 净化

将中性氧化铝柱串接在WCX柱上方，用3 mL乙腈活化中性氧化铝小柱和WCX萃取小柱。用6 mL乙腈分三次(每次2 mL)涡旋振荡溶解上步提取液残留物，并依次过柱，控制WCX柱上样流速约为1.0 mL/min，再用2 mL 乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3 mL水、3 mL乙腈淋洗WCX柱，弃去上述滤液。用4 mL甲酸甲醇溶液(5.6)洗脱，洗脱流速约为1 mL/min，收集洗脱液，在40℃氮气吹干，用1.0 mL甲醇溶液(5.10)定容，充分振荡溶解残渣，用0.45 um滤膜过滤，待测。

7.3 测定

7.3.1 色谱条件

a)色谱柱：C₁₈柱100×2.1mm(内径)，5 um;

b)柱温：25℃;

c)进样量：25 uL;

d)梯度洗脱。

7.3.2 质谱条件

a)离子源：电喷雾源(ESI)，正离子；

b)扫描方式：选择反应监测(SRM)；

c)雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气或其他高纯气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求;

d)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度。

7.3.3 色谱测定

根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准工作液应有五个浓度水平，应包括零点。标准工作液和待测样液中亚甲基蓝的响应值均应在仪器线性响应范围内。

7.3.4 定性测定

进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表1中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

表1 定性确证时相对离子丰度的最大允许相对偏差

7.3.5 空白实验

除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。

8 结果计算和表述

用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式(1)计算试样中亚甲基蓝药物的残留量：

式中：

X—试样中亚甲基蓝药物残留量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

V—样品最终定容体积，单位为毫升(mL);

c—由标准曲线而得的样液中亚甲基蓝药物的含量，单位为微克每升(ug/L) ;

c₀—由标准曲线而得的空白实验中亚甲基蓝药物的含量，单位为微克每升(ug/L);

m—试样量，单位为克(g)。

9 测定低限与回收率

9.1 测定低限

本方法的测定低限为：0.005 mg/kg。

9.2 回收率

—在添加浓度为0.005mg/kg时，回收率为74.0％～100.4％;

—在添加浓度为0.010 mg/kg时，回收率为77.4％～96.8％;

—在添加浓度为0.040 mg/kg时，回收率为75.2％～102.0％。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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